葛根标准汤剂制备工艺的优化

郭怡敬，于 欢，龚千锋，钟凌云*，谌瑞林，朱卫丰

(1.江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004；2.江西江中中药饮片有限公司，江西 九江 332000）

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi 的干燥根,性凉,味甘、辛,归脾胃经,具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效［1］,主要化学成分为异黄酮、葛根皂苷等。现代研究表明,葛根对维持心血管系统稳定、改善肝肾功能、提高代谢与免疫功能、抗氧化等均有一定作用［2-3］。

中药饮片标准汤剂是以中医理论为指导,临床应用为基础,经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂［4-5］。由于药材质地、性味、功效均有差异,为了保障临床用药准确安全、疗效一致,传统汤剂制备工艺应做出适当调整［6］。但葛根作为常用解表药,目前尚无其标准汤剂具体制备工艺,故本实验在5、10、15 倍加水量下于不同时间点［7］绘制含量-时间动态分布趋势图,采用多指标层次分析法(AHP)［8］结合响应面法优化葛根标准汤剂制备工艺,以期为后续相关产品开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695 型高效液相色谱仪,配置Empower 色谱工作站 (美国Waters 公司)；AE240 电子分析天平［十万分之一,梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司］；水相、有机相过滤膜(上海市新亚净化器件厂)；不锈钢蒸煮锅(浙江苏泊尔股份有限公司)；细筛(上海新正机械仪器制造有限公司)。

1.2 试剂与药物 3′-羟基葛根素 (批号CHB170224,纯 度≥98%)、葛根素 (批 号CHB170227,纯度≥98%)、3′-甲氧基葛根素(批号CHB180124,纯度≥98%)、葛根素芹菜糖苷(批号CHB170228,纯度≥98%)、大豆苷(批号CHB180713,纯 度≥98%)、染料木苷 (批 号CHB170223,纯 度≥98%)、芒柄花苷 (批 号CHB171026,纯度≥98%) 对照品(成都克洛玛生物技术有限公司)。葛根饮片由岳西县沈桥中药材专业合作社提供,经江西中医药大学龚千锋教授鉴定为正品,符合2020 年版《中国药典》 一部要求。甲酸为色谱纯［批号A117-50,赛默飞世尔科技(中国) 有限公司］；乙腈为色谱纯(批号AC-1026-4000,美国ACS 恩科化学)；乙醇为分析纯(批号18092202,西陇科学股份有限公司)；水为超纯水［经Milli-Q 系统(美国Millipore 公司) 净化］、娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 各成分含量测定

2.1.1 色谱条件 参考文献［9］ 报道。Titank-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -水(含0.1%甲酸)(B),梯度洗脱(0～12 min,8%～10% B；12～30 min,10%～12% B；30～60 min,12%～30%B)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长250 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 对照品溶液制备 分别精密称取葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、芒柄花苷、染料木苷9.24、4.14、3.12、4.39、4.48、2.21、3.12 mg,置于5 mL 量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,各精密吸取2 mL,置于25 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,摇匀,即得,置于4 ℃冰箱中保存。

2.1.3 供试品溶液制备 精密吸取葛根水煎液2 mL,置于10 mL 量瓶中,30%乙醇定容至刻度,摇匀,即得,置于4 ℃冰箱中保存。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液适量,甲醇制成6 种质量浓度,在“2.1.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定。以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液10 μL,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷峰面积RSD 分别为 0.89%、0.59%、0.57%、0.52%、0.54%、1.48%、0.75%,表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批标准汤剂,按“2.1.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷峰面积RSD 分别为1.13%、2.35%、2.98%、2.40%、0.64%、2.45%、0.91%,表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷峰面 积 RSD 分别为 1.91%、0.61%、2.04%、0.21%、0.19%、1.98%、1.23%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密吸取供试品溶液1 mL,共6 份,按各成分含量100%水平精密加入对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,葛根素、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷平均加样回收率分别为98.9%、103.3%、95.9%、95.7%、100.7%、96.0%、96.9%,RSD 分别为 0.28%、0.17%、0.19%、0.10%、0.03%、0.06%、0.02%。

2.2 单因素试验 参考文献［7］ 报道。精密称取葛根饮片100 g,共3 份,分别加入5、10、15倍量水浸 泡5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min 后各取药液5 mL,同时补加同温介质5 mL,精密吸取1 mL,置于10 mL 棕色量瓶中,30%乙醇定容,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,中火煎煮,药液沸腾后保持微沸状态,在煎煮5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min 后各取药液5 mL,同时补加同温介质5 mL,精密吸取1 mL,置于10 mL 棕色量瓶中,30%乙醇定容,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,绘制主要化学成分含量-时间动态分布趋势图,结果见图2。

2.2.1 加水量 中药在浸泡过程中会吸水,其含量受质地影响,不同类型饮片加水量也应有所差异［4］。中药煎药室管理规范要求,水量一般没过药材2～5 cm,根及根茎类、果实种子类饮片加水量为饮片量的7 倍,并根据实际状态适时调整［9］,而日本汉方制剂工艺中一般加入全生药量20 倍量的水［10］。文献［11］ 报道,53 味中药饮片平均吸蓄量为1.6 mL/g,其中根茎类为1.8 mL/g。本实验考察了加水量5、10、15 倍,发现5、10 倍下各成分含量高于15 倍下,故选择5、7、9 倍作进一步研究。

2.2.2 浸泡时间 中药饮片在煎煮前浸泡时,可使其表面湿润变软,植物细胞膨胀,从而有利于有效成分溶出,同时组织内产生渗透压而扩散到组织细胞外部水中,可避免在加热煎煮时药材组织内蛋白质固化、淀粉糊化而影响活性物质煎出［12］。研究表明,浸泡时间对药材中有效成分含量有明显影响,可影响临床效果［13-14］。图2 显示,浸泡20 min后各成分溶出趋于平缓,葛根饮片已无干心,故选择20、30、40 min 作进一步研究。

2.2.3 煎煮时间 葛根为发散风热药,故相关汤剂煎煮时间应根据其功能主治和药物功效来确定。一般药物煮沸后再煎煮20～30 min；解表类、清热类、芳香类药物不宜久煎,煮沸后再煎煮15～20 min即可,但也有学者认为,辛温解表剂、扶正解表剂应适当久煎,而辛凉解表剂煎煮时间宜短,不能一概而论［6］。图2 显示,加热15 min 内各成分含量显著上升,15～35 min 持续增加,35 min后开始波折下降,整体趋势虽上升,但药液也明显浓缩而导致水分损失,浓度变高。煎煮时间过长,会使中药中部分成分发生水解,导致其含量降低［15］,临床上煎煮一般为二煎,时间略短于一煎,而现代研究中往往煎煮时间相同［16］。最终,本实验选择15、25、35 min 作进一步研究。

2.3 层次分析法 葛根素是葛根质量控制的指标成分,而3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷含量较低,染料木苷、芒柄花苷含量最低,故将上述7 种成分分为4 个层次,构建优先判断矩阵,得到相对评分,结果见表2,发现CR＜0.1,表明矩阵符合一致性检验,权重系数合理有效。综合评分Y计算公式为Y=3′-羟基葛根素含量×0.077 2/最大值+葛根素含量×0.429 6/最大值+3′-甲氧基葛根素含量×0.144 6/最大值+葛根素芹菜糖苷含量×0.144 6/最大值+大豆苷含量×0.144 6/最大值+染料木苷含量×0.029 7/最大值+芒柄花苷含量×0.029 7/最大值。

图2 各成分含量-时间动态分布趋势Fig.2 Content-time dynamic distribution trends for various constituents

表2 各成分权重系数Tab.2 Weight coefficients for various constituents

2.4 响应面法 以加水量(A)、浸泡时间(B)、煎煮时间(C) 为影响因素,3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷含量的综合评分为评价指标,响应面法优化制备工艺,结果见表3,模型拟合分析见表4。

采用Design-Expert8.0.6 软件进行多元线性回归和二项式拟合,得到方程分别为Y=0.720+0.120A+8.993×10-3B+0.094C(R2=0.644 2)、Y=0.740+0.120A+8.993×10-3B+0.094C+0.053AB+0.024AC+0.035BC-0.063A2+0.025B2+1.182×10-3C2(R2=0.869 6),故选择二项式拟合模型,方差分析见表5,可知各因素影响程度依次为A＞C＞B；模型P＜0.01,表明其达到极显著水平。响应面分析见图3,可知最优工艺为加8.72 倍量水浸泡39.9 min 后煎煮34.4 min,结合实际操作,将其修正为加9 倍量水浸泡40 min 后煎煮35 min。

再按照优化工艺进行3 批验证试验,测得3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷含量RSD 分别为 0.98%、4.14%、4.36%、2.11%、1.28%、4.40%、1.98%,均小于5%,表明该工艺合理可行。取葛根饮片适量,按照一般饮片标准汤剂工艺(浸泡30 min,头煎7 倍量水30 min,二煎6 倍量水20 min,浓缩至5 倍饮片质量)［4］进行煎煮,平行3 次,测得7 种成分平均含量分别为0.088%、1.087%、0.376%、0.345%、0.157%、0.009%、0.011%,综合评分为0.594,优于一般饮片标准汤剂工艺。

表3 试验设计与结果Tab.3 Design and results of tests

表4 模型拟合分析Tab.4 Fitting analysis of models

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

3 讨论

由于解表药标准汤剂缺乏具体的工艺参数,故本实验对加水量、浸泡时间、煎煮时间进行考察,不仅可为葛根标准汤剂的制备工艺提供依据,还能为其他解表药提供参考。另外,在“解表类、清热类、芳香类不宜久煎,煮沸后再煎煮15～20 min” 的标准规范下,应区别对待解表药,尤其是药效成分不以挥发油为主者。

2020 年版《中国药典》 项下葛根成分检测指标仅有葛根素,但中药组成复杂,单一化合物不能充分评价其质量。葛根主要有效成分为黄酮,包括葛根素、大豆苷、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素等,近年来大量研究表明,它们具有广泛的药理作用,如抗氧化、抗肿瘤、调节血糖、治疗心脑血管疾病、改善肠道菌群等［17-21］。本实验采用层次分析法对多成分指标得到的权重系数进行综合评分,通过响应面法计算响应值,进而确定最佳工艺。对比《医疗机构中药煎药室管理规范》 规定,本实验可使结果更加科学化,并验证了葛根标准汤剂制备工艺的合理性。

葛根作为常见的药食同源中药,近年来受到人们广泛关注,将其制成标准汤剂能更好地服务于患者。目前,汤剂存在许多问题,如规范不一、用法不同等,故明确标准汤剂的制备工艺既能为葛根临床应用提供理论基础,又可促进相关新剂型的开发。

图3 各因素响应面图Fig.3 Response surface plots for various facotrs