UPLC-QQQ-MS/MS 法同时测定风湿安泰片中12 种成分

陈玉华，卢 松

(1.湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435000；2.黄石市中医医院康复科，湖北 黄石 435003）

风湿安泰片是由马钱子(制)、羌活、麻黄、红花、红参、金银花、黄柏、淫羊藿等25 味药材组成的纯中药制剂,具有舒筋活血、祛风镇痛作用,临床上用于治疗腰腿疼痛、风湿性关节炎等［1-2］,方中马钱子(制) 属于毒性药材,主要有效成分为马钱子碱、士的宁,毒性较大,安全范围较窄［3］。2020 年版《中国药典》 一部规定,风湿安泰片中羌活、麻黄、金银花、黄柏、淫羊藿、红参的有效成分分别为异欧前胡素、麻黄碱和伪麻黄碱、绿原酸、小檗碱、柚皮苷和淫羊藿苷、人参皂苷(Rg1、Rb1、Re),但其现行标准［4］质量控制水平落后,未对其有效成分进行含量测定。目前,风湿安泰片中指标成分含量测定有少量报道［5-7］,但尚未涉及3 种以上。

UPLC-MS/MS 具有高灵敏度、高专属性的特点,可简化复杂混合物的分离纯化过程［8］,近年来被广泛应用于中成药中多成分的定量测定［9-17］。因此,本实验采用该方法同时测定风湿安泰片中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、士的宁、马钱子碱、绿原酸、盐酸小檗碱、柚皮苷、淫羊藿苷、异欧前胡素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的含量,以期为评价该制剂的质量特征提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 超高压液相色谱系统,配置6460 QQQ 三重四级杆质谱仪(美国Agilent 公司)；KS-9983-2 双频台式超声波清洗机(45 kHz、500 W,郑州万博仪器设备有限公司)；XD205DU电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试剂与药物 盐酸麻黄碱 (批号171241-201809,纯 度 100%)、盐酸伪麻黄碱 (批 号171237-201510,纯 度99.8%)、士的宁 (批 号100240-200701,纯度100%)、马钱子碱 (批号110706-200505,纯 度95.9%)、绿原酸 (批 号110753-202018,纯度96.8%)、盐酸小檗碱(批号110713-201814,纯 度86.7%)、柚皮苷 (批 号110722-201815,纯度91.7%)、淫羊藿苷 (批号110737-201516,纯度94.2%)、异欧前胡素(批号110827-201812,纯度99.6%)、人参皂苷Rg1 (批号110703-201933,纯度93.4%)、人参皂苷Rb1(批号110704-202028,纯度93.1%)、和人参皂苷Re (批号110754-202028,纯度93.9%) 对照品均购自中国食品药品检定研究院。风湿安泰片(通化茂祥制药有限公司,批号180401、180402；山西仁源堂药业有限公司,批号20 191102；河南辅仁堂制药有限公司,批号191101、190604；通药制药集团股份有限公司,批号191114)。甲醇、乙腈、乙酸为色谱纯(德国Merck 公司)；超纯水由Milli-Q 超纯水仪制备。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、士的宁、马钱子碱、绿原酸、盐酸小檗碱、柚皮苷、淫羊藿苷、异欧前胡素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re 对照品各10 mg,置于10 mL 量瓶中,70%甲醇稀释至刻度,制得1 mg/mL 贮备液。分别精密量取0.02、0.02、0.5、0.5、2.0、1.0、2.0、1.0、0.2、0.1、0.1、0.2 mL,置于同一50 mL 量瓶中,70%甲醇稀释至刻度,摇匀,制得各成分质量浓度分别为0.42、0.47、13.14、12.04、39.08、21.09、40.02、4.28、2.00、20.35、2.27、4.12 μg/mL 的贮备液,各精密量取1 mL 至50 mL 量瓶中,70%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

2.2 供试品溶液制备 取片剂10 片,研成细粉,精密称取0.4 g,置于50 mL 量瓶中,70%甲醇超声处理20 min 溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.3 UPLC 条 件Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流动相0.1% 乙酸(A) -甲醇(B),梯度洗脱(0～7 min,5%B；7～15 min,5%～70% B；15～22 min,70%～100% B；22～23 min,100%～5%B；23～30 min,5%B；30～35 min,5% B)；体积流量0.2 mL/min；柱 温40 ℃；进样量1 μL。

2.4 MS 条件 电喷雾离子源,正离子模式(ESI+),多反应监测(MRM),温度350 ℃；雾化器压力40 psi (1 psi=0.133 kPa)；干燥气体积流量12 L/min,温度250 ℃。分别对每种成分进行二级质谱扫描,选择响应值最大的碎片离子作为定量离子对,第二大者作为定性离子对,离子对检测参数见表1。

表1 离子对检测参数Tab.1 Detection parameters for ion pairs

2.5 系统适用性试验 取对照品、供试品溶液,在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定,各成分总离子流图见图1。由此可知,麻黄碱、伪麻黄碱虽然有相同定量离子对,但通过调整流动相比例能使两者有效分离,并且对照品定位可对其进行有效定性与定量；各成分响应值虽然有所差异,但均对测定无干扰。

图1 各成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察 精密吸取“2.1” 项下贮备液1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02 mL,置 于10 mL量瓶中,70% 甲醇制成系列质量浓度,在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定。以峰面积为纵坐标(Y),各成分质量浓度为横坐标(X) 进行回归,并分别以S/N=3、S/N=10 为检测限(LOD)、定量限(LOQ),结果见表2,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 精密吸取“2.1” 项下对照品溶液1 μL,在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定6次,测得麻黄碱、伪麻黄碱、士的宁、马钱子碱、绿原酸、小檗碱、柚皮苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、淫羊藿苷、人参皂苷Rb1、异欧前胡素峰面积RSD 分别为0.9%、1.1%、0.7%、0.6%、1.0%、1.1%、0.8%、0.6%、0.7%、0.5%、0.2%、1.0%,表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 取同一批片剂(批号180401),按“2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液,在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定,测得麻黄碱、伪麻黄碱、士的宁、马钱子碱、绿原酸、小檗碱、柚皮苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、淫羊藿苷、人参皂苷Rb1、异欧前胡素含量RSD 分别为0.4%、0.5%、0.8%、0.4%、0.5%、0.3%、0.9%、1.0%、0.7%、0.9%、1.0%、0.2%,表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取同一批片剂(批号180401),按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,于0、1、2、4、8、16、24 h 在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定,测得麻黄碱、伪麻黄碱、士的宁、马钱子碱、绿原酸、小檗碱、柚皮苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、淫羊藿苷、人参皂苷Rb1、异欧前胡素峰面积RSD 分别为1.1%、1.0%、0.9%、1.2%、0.6%、1.2%、1.2%、1.1%、1.5%、0.8%、0.8%、1.2%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验 取各成分含量已知的片剂(批号180401) 10 片,研成细粉,精密称取9 份,每份0.2 g,置于50 mL 量瓶中,精密加入“2.1”项下贮备液0.8、1.0、1.2 mL,每个水平平行3 份,70%甲醇超声处理20 min 并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定,计算回收率。结果,麻黄碱、伪麻黄碱、士的宁、马钱子碱、绿原酸、小檗碱、柚皮苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、淫羊藿苷、人参皂苷Rb1、异欧前胡素平均加样回收率分别为93.51%、101.6%、99.6%、97.1%、96.5%、101.2%、102.3%、95.3%,103.2%、100.2%、98.7%、99.3%,RSD 分别为0.9%、1.9%、1.7%、0.8%、0.8%、1.1%、1.2%、1.1%、0.9%、1.2%、1.1%、1.2%。

2.11 样品含量测定 取4 个生产厂家6 批片剂,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,每批平行2份,在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定,外标法计算含量,结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（n=2）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n=2）

3 讨论

盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱属于同分异构体,具有相同的定量离子对,需要通过对照品定位进行定性。当有机相比例为5% 时,两者能有效分离,而且甲醇分离度优于乙腈。

本实验以水-甲醇、水(含0.1%甲酸) -甲醇、水(含0.1% 乙酸) -甲醇、水(含10 mmol/L 甲酸铵) -甲醇为流动相,考察各成分分离度及响应值,发现水相中加入乙酸后更容易使化合物离子化,从而提高各成分响应值,而盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱在水(含0.1% 乙酸) -甲醇中的分离度最好。然后,考察了提取溶剂(水、50% 甲醇、70% 甲 醇、甲 醇)、提取时间(10、20、30、40 min),发现70%甲醇提取出的成分最多；超声处理20 min 后各成分提取完全。最终确定,供试品溶液制备方法为70%甲醇超声提取20 min。

在6 批风湿安泰安片中,各成分含量差异较大,以绿原酸最明显(301.21～645.56 μg/g),其次是士的宁 (84.44～256.05 μg/g)、马钱子碱(93.78～278.35 μg/g),差异最小的为人参皂苷Rb1 (1.04～5.54 μg/g)。虽然结果均在设计的曲线范围内,但相关生产厂家也应加以关注。