间充质干细胞在肝纤维化治疗中的研究进展

康艳敏，叶俊松，邹征伟，张敏鸿，刘书画，李 艺，何正义，叶军明

（1.赣南医学院2018级硕士研究生；2.赣南医学院第一附属医院；3.赣南医学院干细胞临床转化分中心；4.赣南医学院2019级硕士研究生；5.赣南医学院，江西 赣州 341000）

肝纤维化（Hepatic fibrosis，HF）是酒精、药物、化学毒性或肝炎病毒感染等有害因素的作用下导致肝硬化、肝癌、肝衰竭的一个中间病理过程［1］，炎症反应增强和细胞外基质（Extra cellular matrix，ECM）过度堆积是肝纤维化形成过程中主要病理特征，如果没有采取积极正确的处理，肝纤维化可发展为肝硬化等终末期肝病，导致患者需要肝移植。目前，肝移植是终末期肝病患者唯一可行的治疗选择，但其应用受到医疗费用昂贵、供体资源短缺、需要终生免疫抑制治疗和移植排斥反应等后遗症的限制［2］。因此，寻找新的行之有效的治疗策略改善肝纤维化患者症状，抑制其进一步向终末期肝病的发生发展，具有十分重要的意义。

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一类具有自我更新和分化潜能的成体干细胞。MSCs 因其具有多向分化潜能、增殖能力强、免疫调节和自我复制等特点［3］，成为治疗肝纤维化最有前途的候选细胞。间充质干细胞可以从多种组织中获得，包括骨髓、脂肪组织、脐带组织、胎盘、脐带血、羊水、外周血、肝、肺、牙髓、骨骼肌和毛囊。国际细胞治疗学会提出了以下定义MSCs 的最低标准：（1）贴壁生长；（2）存在特定的细胞表面抗原标记物CD73、CD90、CD105，同时不存在CD14、CD34、CD45 和HLA-DR 等其他标记物；（3）在体外有分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的能力［4］。

1 肝纤维化发生的分子机制

肝纤维化（Hepatic fibrosis，HF）是严重慢性肝损伤的常见结果，其特征是细胞外基质（ECM）的产生和降解失衡。通常由病毒、酒精、滥用药物和自身免疫力触发［5］。在肝纤维化的早期阶段，ECM 的沉积可以被蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶水解。然而，持续的损伤会导致基质成分的积累，如Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，导致瘢痕组织沉积和炎症过程的开始［6］。

肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）位于肝窦内皮细胞和肝细胞之间的Disse窦周间隙，是储存维生素A 的细胞。越来越多的研究表明HSCs 是合成和分泌细胞外基质成分的主要细胞，在肝纤维化中起关键作用。在物理、化学或生物因素对肝脏造成损伤时，HSCs 被激活并迅速增殖；HSCs 的活化是肝纤维化的重要因素。转化生长因子-β 是肝纤维化的关键介质，它触发HSCs 的激活，诱导细胞外基质合成，增加肝细胞凋亡［7］。活化的HSCs通过旁分泌和自分泌方式促进外周静止性HSCs 的活化，在各种细胞因子的作用下转化为肌成纤维样细胞，获得了收缩和纤维化的特性，分泌细胞因子，表达α平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA），α-SMA 不仅是门静脉肌成纤维细胞的标志，也是HSCs活化的标志。

研究发现［8］多种细胞因子包括转化生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（CTGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、干扰素和瘦素，通过多种信号通路如TGF-β/Smad、JINK/ERK、Notch 和Wnt/β-catenin 参 与HSCs 的 激活。其中TGF-β/Smad 通路是与肝纤维化相关的最重要的信号通路之一［9］，Smad 蛋白家族参与TGF-β下游信号通路，激活受体的蛋白包括Smad3，可以将信号从胞浆传递到细胞核，从而促进肝纤维化的发生；而发挥抑制功能的蛋白Smad7，可以阻止Smad复合物的形成及由此产生的信号转导过程，从而抑制纤维化的起始。另外，肝kuppfer 细胞是体内固定型巨噬细胞中最大的细胞群体，肝脏受损后，kuppfer 细胞和血液系统中的单核细胞会趋化到局部的肝损伤区域，清除异物及细胞碎片，同时分泌大量的炎性因子如TNF-α、TGF-β、IL-1，激活邻近的HSCs，促进HF（图1）。综上所述，HF 与多种细胞因子、多种细胞类型和多种信号通路有关。如果没有得到有效的治疗，可能会发生肝硬化或肝功能衰竭，并增加患肝细胞癌的风险［6］。

图1 肝纤维化的过程

2 间充质干细胞的生物学特性及修复肝纤维化的可能机制

2.1 骨髓来源的间充质干细胞

2.1.1 骨髓间充质干细胞的生物学特性骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）首先在骨髓中被发现，胞体呈纺锤形、梭状，漩涡状生长，排列紧密、形态均一，具有广泛的自我更新和分化为多种细胞系的能力，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞［10］。研究表明，骨髓间充质干细胞有分化肝细胞以替代受损肝细胞的能力，并抑制肝星状细胞活化和促进肝星状细胞凋亡进而修复受损的肝脏［11］。BMSCs 能够分化为肝细胞样细胞，并分泌多种细胞因子来调节免疫反应，表明它们具有强大的抗氧化特性。这些能力使BMSCs 能够对抗肝纤维化，而不受病因的影响［12］。BMSCs 作为最早发现的MSCs 被广泛、深入研究，并有取自患者自身的BMSCs用于临床实践研究。

2.1.2 骨髓间充质干细胞修复肝纤维化的机制研究表明，激活的Wnt/β-catenin 信号传导途径可以促进包括WISP1 和Cyclin D1 基因的转录，它们在HSCs 增殖、转移和ECM 形成中起重要作用［13］。另外，α-SMA 在肝组织中的表达作为肝星状细胞活化的指标，它的上调是肝纤维化发生和发展的特异性标志［14-15］。研究人员发现BMSCs在体内和体外实验中均可显著降低α-SMA 表达，抑制HSCs 增殖和活化并随后抑制肌成纤维样细胞，导致胶原蛋白降解并 减 少 肝 纤 维 化。JANG 等［16］通 过 对BMSCs 和HSCs 体外直接共同培养，发现α-SMA 极度下降，HSCs 活性大幅降低，证明BMSCs 自分泌可诱导HSCs 凋亡，降低HSCs 活化的准确性；通过BMSCs和HSCs 体内间接共同培养模拟旁分泌，导致可刺激HSCs 活化的TGF-β1、IL-6 减少，抑制HSCs 活化的肝细胞生长因子（HGF）、IL-10 增加，证明BMSCs可通过旁分泌来抑制HSCs 的活性。另有研究发现BMSCs 和HSCs 在体外共培养抑制HSCs 增殖的内在分子机制是BMSCs 通过增加HSCs 的Notch1 表达水平，继而通过PI3K/Akt 信号通路对话下调Akt 磷酸化而抑制肝星状细胞增殖［17］。当BMSCs 作用于HSCs 后，诱导HSCs Dlk-1 下调，而Dlk-1 下调诱发Nothch1信号通路激活、表达增加，抑制HSCs的增殖从而逆转肝纤维化的发生［18］（表1）。即Dlk1/Notch信号通路可能是BMSCs 作用于HSCs 逆转肝纤维化的另一机制。

2.2 脐带来源的间充质干细胞

2.2.1 脐带间充质干细胞的生物学特性脐带间充质干细（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）是一类从脐带组织中分离获得的原始类型的干细胞，表型介于成体干细胞和胚胎干细胞之间，表达各种胚胎干细胞的独特分子标记，如OCT4、SOX2 和NANOG［19-20］。UC-MSCs 不 仅 具 有MSCs 的共同特性，而且具有更稳定的生物学特性。UC-MSCs 可以从羊膜、羊膜下、血管周围、华通胶和脐带血中获得，目前华通胶已经成为UC-MSCs 的主要来源［21-22］。UC-MSCs 可以在婴儿出生后获得，对产妇和婴儿无影响，这种相对方便和容易获得使UC-MSCs 成为MSCs 的理想来源［23-24］。UC-MSCs 除表达其他MSCs 的标志外，还特异性表达主要组织相容性复合体-Ⅰ［25］，并结构性地表达T 细胞激活的负调节因子B7 同系物1，不表达主要组织相容性复合体-Ⅱ或共刺激分子CD80 和CD86，这可能促进UC-MSCs的同种和异种移植。

2.2.2 脐带间充质干细胞修复肝纤维化的机制UC-MSCs 具有多项分化潜能，可以分化为内胚层细胞类型以及大多数中胚层和外胚层细胞类型［26］。多项研究表明，UC-MSCs在体外可以分化为肝细胞样细胞。赵勤军等［27］加入细胞因子获得的hUC-MSCs具有较高的肝细胞分化能力和肝细胞特异性功能。UC-MSCs 可以分泌多种细胞因子、HGF 和IL-10［28］，促进肝脏修复、抑制肝硬化的发生发展。UC-MSCs的旁分泌作用可能是通过抑制TGF-β、Smad1 和Smad3 的表达，增强Smad7 蛋白的表达，从而抑制HSCs 的增殖［29］。研究人员［30］研究了UC-MSCs 在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中的抗纤维化潜力，UC-MSCs 可以运送GPX1，通过降解CCl4和H2O2，减少肝细胞的氧化应激和凋亡，从而发挥肝细胞保护作用［31］（表1）。UC-MSCs 干预组大鼠血清ALT、AST、丙二醛、羟脯氨酸、层粘连蛋白、TGF-β1和INF-α水平明显降低，反之谷胱甘肽水平显著升高，提示UC-MCSCs 可能通过减少氧化应激和炎症介质进而减轻肝纤维化［30］。

2.3 脂肪来源的间充质干细胞

2.3.1 脂肪间充质干细胞的生物学特性脂肪间充质干细胞（Adipose tissue derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs）是一种来源于脂肪组织的间充质干细胞，因其来源广泛、易于采集、含量丰富、分化能力强和低免疫源性等优越的特性，在临床应用中展现出广阔的应用前景，有望成为治疗肝病领域极具潜力的种子细胞［32］。AD-MSCs 细胞呈纺锤形、增长迅速，常呈旋涡状排列，在特定诱导因子的作用下，可以分化为多种细胞，包括脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞，肌细胞和肝细胞［33］。AD-MSCs 作为一种成体干细胞，具有特异性的细胞表面抗原标记物，CD44、CD73、CD105、CD90 阳性表达，CD14、CD34、CD45阴性表达［34-35］，这些特异性的细胞表面抗原标记物常作为细胞筛选和细胞鉴定的理论依据。

2.3.2 脂肪间充质干细胞修复肝纤维化的机制AD-MSCs 移植治疗肝脏疾病的作用是通过分化为肝细胞样细胞或（和）通过旁分泌的方式分泌细胞因子，进而促进残存肝细胞生长并修复受损组织［36］。JNK激酶通路的激活被认为是介导细胞凋亡的关键信号通路，JNK 在HSCs 的表达显著增加，其下游分子p53 也被磷酸化，随后抑制了效应因子caspase-3，从而诱导了HSCs 凋亡，并抑制了α-SMA的表达。JNK的持续激活与抑制细胞外信号调节激酶（ERK）有关，这表明ERK 和JNK 激活之间的动态平衡在细胞存活或细胞凋亡中可能具有重要作用［37］。研究发现肝细胞生长因子介导了一条bax 非依赖性的凋亡通路，该通路降低了NF-κB 的活性，激活了JNK1。HGF 和EGF 诱导的JNK1 激活表现出相似的动力学，提示HGF和EGF 受体信号通路之间可能存在关联。研究发现，AD-MSCs 移植后血清透明质酸水平降低，肝纤维化相关因子α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP1）表达减少，肝纤维化程度明显改善，其主要分子机制是通过抑制JNK、NF-κB和Smad2/3信号转导而实现的［38］（表1）。

表1 间充质干细胞修复肝纤维化的分子机制总结

3 间充质干细胞治疗肝纤维化的新技术

3.1 uPA 基因修饰的BMSCs 下调Wnt 信号通路减轻大鼠肝纤维化Wnt信号通路由高度保守的分泌糖蛋白家族组成，它们在器官发生、组织内稳态和许多人类疾病的发病机制等多种生物过程中发挥重要作用［39］。研究发现，Wnt 信号通路明显参与HSCs活化，导致肝纤维化。在典型的Wnt信号通路中，β-catenin 是介导Wnt 信号从细胞膜到细胞质的主要下游效应器［40］。尿激酶纤维蛋白原溶酶原激活剂（Urokinase plasminogen activator，uPA）是一种特殊的丝氨酸蛋白酶，能将失活的纤溶酶原转化为活性的纤溶酶，从而直接降解细胞外基质并催化潜伏期基质金属蛋白酶（MMPs）的激活［41］。马志刚等［42］的研究发现uPA 基因修饰的BMSCs 通过增强uPA 表达以改善ECM 降解、下调Wnt 信号转导相关分子mRNA 和蛋白表达，干扰下游的β-连环蛋白由细胞膜转入细胞质过程，从而抑制HSCs 的激活，显著改善了肝功能并减弱CCl4诱导的肝纤维化，从而提供了一种新的有效抗肝纤维化治疗方法。

3.2 UC-MSCs 来源的外泌体抗肝脏纤维化作用外泌体（Exosomes，Ex）即MSCs分泌的直径40～100 nm双层膜细胞外小泡（Extracellular vesicles，EVS）［43］，表达CD9 和CD81，是一种新的细胞间通讯机制［44］。Ex 优于其亲本细胞，体积比其亲本细胞小、结构简单，无细胞活性、不存在肿瘤形成的风险、膜结合蛋白的含量较低、免疫原性比其亲本细胞低等［45］。从UC-MSCs 获得的富含MIR-455-3P 的Ex 可以减轻巨噬细胞的浸润和局部肝损伤，降低血清炎症因子水平，从而改善肝脏组织学和全身疾病［46］。hUC-MSC-Ex通过失活TGF-β1/Smad 信号通路，抑制肝细胞EMT，从而减轻肝损伤。研究发现，hUC-MSC-Ex移植减轻了四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化中的肝脏炎症和胶原沉积，减少了肝脏表面纤维包膜并能明显恢复ALT、AST 活性，降低Ⅰ型和Ⅲ型胶原、TGF-β1和磷酸化Smad2的表达。

3.3 AD-MSCs 联合EUG 通过调节TGF-β/Smad提高大鼠抗纤维化活性丁香酚（Eugenol，EUG）是丁香精油的活性成分，在体内通过抑制诱导型一氧化氮合酶途径来发挥抗纤维化作用。据研究报道［47］AD-MSCs 和EUG 联合治疗可显著提高纤维化大鼠血浆纤维蛋白原浓度、抗炎细胞因子水平和增殖细胞核抗原表达，并显著降低血清肝酶（ALT 和AST）、炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）、纤维化标志物（Ⅲ型胶原、透明质酸、羟脯氨酸）和TGF-β的水平。此外，联合治疗比单独使用AD-MSCs 明显降低肝纤维化标志物（COL-I 和α-SMA）和蛋白（α-SMA、TGF-β1、smad3）的表达，联合治疗较单用AD-MSCs 有更强的抗纤维化作用，提示AD-MSCs 与EUG 有协同作用。联合治疗组血清HGF 水平明显升高，提示肝组织修复和组织重塑。有报道称，在纤维化模型中，MSCs降低TIMP-1的表达或增加MMPs的表达，在纤维化的消退过程中发挥作用［48］。EUG可能通过不同机制提高AD-MSCs 的抗纤维化、抑制炎症启动的能力，并促进AD-MSCs与肝细胞的融合，有助于微环境的改变和向肝细胞分化，从而增加组织再生，抑制肝纤维化的发展。此外，EUG 可增加AD-MSCs 对损伤肝脏的归巢能力，诱导肝细胞更多分化，导致AD-MSCs和EUG处理的纤维化大鼠肝细胞PCNA 表达增加，且高于单独应用AD-MSCs 的大鼠。

4 总结和展望

肝脏是一个储存糖原、清除毒素、参与蛋白质合成以维持代谢稳态的重要消化器官。由于与外界毒素直接接触，肝脏在应激条件下很容易受到损伤。肝硬化在全球范围内是一个沉重的健康负担，每年约有280 万人受到影响，并导致130 万人死亡［49］。肝纤维化是多种原因导致的慢性肝损伤的一个中间病理环节，以肝组织弥漫性纤维化、再生结节和假小叶为特点，其机制至今仍不完全明确。目前，虽然有多种药物可用于恢复患者的肝功能，但几乎没有有效的药物来逆转先前存在的肌成纤维细胞和细胞外基质的积聚。

MSCs 是源于中胚层间充质的干细胞，拥有自我复制和多向分化潜能，具有免疫调节、抗炎症反应和外分泌营养等功能。MSCs 已被用于治疗多种疾病，如神经、心脏、肝脏、肠道和肺部疾病，根据ClinicalTrials.gov 的数据，在各个领域已经注册了900 多项临床试验，其中与肝纤维化相关的临床试验在进行的就有49 项。MSCs 以其独特的优势在临床应用方面展现出广阔的应用前景，然而其在治疗肝纤维化疾病的机制还未完全阐明，甚至有完全相反的结果呈现，未来需要更多基础机制研究来确定治疗特定肝病的最有效的细胞来源、培养条件、细胞数量、给药频率和给药途径，以期在人类肝脏疾病治疗方面发挥巨大的作用。