油茶皂苷对血管瘤EOMA细胞的抑制作用

周光华，谢琼珺，罗 平

（1.南方医科大学第五附属医院眼科，广东 广州 510900；2.赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000）

血管瘤是目前临床上常见的婴幼儿肿瘤，其新生儿患病率为1.1%～2.6%［1］，严重者可损毁容貌。目前临床上主要采用药物、导管介入、硬化剂局部注射、激光及手术治疗等［2］，虽取得一定的治疗效果，但均存在不同程度的不良反应。因此，寻求新的高效低毒的方法是目前研究的热点。近些年，医学者发现中药对其有一定的治疗作用［3］。油茶是一种高营养且无毒的保健食用油［4］。油茶皂苷是其生物活性提取物，具有抗炎、抗高血脂血症、抗渗出及抗肿瘤等作用［5］。本研究通过不同浓度油茶皂苷作用于血管瘤EOMA 细胞，探讨其药理作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂油茶皂苷来自赣南医学院药学院李洪亮课题组，小鼠血管瘤EOMA 细胞由赣南医学院刘潜教授惠赠，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco 公司，CCK8 检测试剂盒、吖啶橙（AO）染色剂及细胞周期检测试剂盒购自于南京凯基生物公司。

1.2 实验仪器液相色谱/质谱仪（美国沃特斯xe‑vog2-xstof）、CO2细胞培养箱（美国Thermo 公司）、全自动酶标仪（Bio-Rad 公司）、低温高速离心机（德国Eppdorff 公司）、流式细胞仪（FACS Calibur，BD 公司）、倒置显微镜和荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 油茶皂苷的提取油茶粕经过粉碎机制成细粉，过40 目筛，称取100 g 油茶粕细粉经石油醚60 ℃回流4 h，脱脂后烘干，用65%乙醇回流提取2 h，提取温度60 ℃，料液比1∶20，浓缩，石油醚，乙酸乙酯洗涤3 次，正丁醇萃取，活性炭脱色，浓缩。样品用洗脱剂溶解，过滤除去不溶性杂质，上样，用甲醇水系统洗脱，浓缩得精制油茶皂苷，液相色谱/质谱仪进样检测，油茶皂苷纯度为85%。

1.3.2 血管瘤EOMA 细胞复苏接种将EOMA 细胞从液氮中取出，快速放入37 ℃水浴锅中，用含10%FBS 的完全培养基重悬混匀后放入37 ℃5%CO2细胞培养箱培养。按1∶3的比例传代，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期生长状态良好的EOMA 细胞，使用培养基调整细胞密度到2.5×105个/mL。

1.3.3 CCK8 法检测细胞增殖接种对数生长期的EOMA 细胞（2.5×105个/mL）于96 孔板，贴壁生长24 h 后，加入不同浓度油茶皂苷（10、20、40、80、160 mg·L-1）作用24 h，加入CCK8 后，继续培养4 h，弃上清，震荡充分溶解，A450 nm检测OD值。

1.3.4 吖啶橙（AO）染色法荧光显微镜下计算细胞凋亡数接种对数生长期的EOMA 细胞于6 孔板，贴壁生长24 h 后，依据CCK8 试验结果将试验分为3 组：EOMA 细胞空白组；20 mg·L-1油茶皂苷处理组；40 mg·L-1油茶皂苷处理组，油茶皂苷作用24 h后消化收集细胞，重复洗涤2 次，重悬细胞，制备细胞悬液106个/mL，取95 μL 细胞悬液加5 μL AO 染液混合后，避光作用10 min，吸5 μL 于载玻片上并用盖玻片封片，荧光显微镜下观察200 个细胞并计数，分别计数活细胞（VN）、凋亡细胞（VA）及坏死细胞（NVN），每个实验组重复3 次。凋亡比例=［VA／（VN+VA+NVN）］×100%。

1.3.5 油茶皂苷对血管瘤EOMA 细胞的周期影响按1.3.4 方法处理后消化收集洗涤细胞，用100 μL PBS 重悬细胞，缓慢加入700 μL 预冷的80%乙醇，使乙醇终浓度为70%；4 ℃固定4 h 以上，1 000 rpm 离心5 min，吸弃固定液，预冷PBS 润洗2次，加入100 μL RNase（50 μg·mL-1），37 ℃水浴30 min；加入400 μL PI（50 μg·mL-1），4 ℃避光染色30 min；流式细胞仪上机检测，分析各细胞周期的比例。

1.4 统计学分析采用SPSS 21.0 对本研究中所有数据进行统计学分析，计数资料以%表示，采用卡方检验，计量资料结果均采用均值±标准差（）表示，两组间比较采用卡方检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 油茶皂苷对血管瘤EOMA 细胞的增殖影响油茶皂苷作用EOMA 细胞24 h 后，随着油茶皂苷的浓度增加其对EOMA 细胞的抑制作用逐渐增强，呈剂量依赖性，与EOMA 细胞对照组比较，差异有统计学意义（F=81.18，P＜0.05）（图1）。

2.2 油茶皂苷诱导血管瘤EOMA 细胞凋亡油茶皂苷作用EOMA 细胞24 h 后，荧光显微镜下可见EOMA细胞数量明显减少，浓缩的绿色荧光，细胞体积缩小，细胞核固缩（图2）。

图1 油茶皂苷对血管瘤EOMA细胞的增殖影响

图2 EOMA细胞形态变化（AO×200）

AO 染色可根据细胞着色及染色质的形态区分出活细胞（VN）、凋亡细胞（VA）和坏死细胞（NVN），油茶皂苷20 mg·L-1组、40 mg·L-1组凋亡率分别为9.5%、14.0%，与对照组相比差异有统计学意义（卡方值为6.105，P＜0.05）（表1）。

表l 不同浓度油茶皂苷对血管瘤EOMA细胞的凋亡影响

2.3 油茶皂苷对血管瘤EOMA 细胞的周期影响与对照组相比，油茶皂苷20 mg·L-1组、40 mg·L-1组细胞G0/G1 期比例显著增加而S 期比例显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 油茶皂苷对血管瘤EOMA细胞的周期影响

3 讨 论

油茶是分布于我国长江流域及其以南地区的一种食用保健油［6］。油茶皂苷是油茶种子经榨油后的残渣中提取出来的活性物——五环三萜类皂苷，具有抗肿瘤的药理学作用［5，7］。研究显示，油茶皂苷可通过提高免疫功能抑制肝癌和肺癌细胞的增殖［8］。体外实验显示油茶皂苷能显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖，其可能机制是激活Caspase信号通路，诱发PARP 底物的断裂，进一步上调IRE1 蛋白的表达水平及活化Perk、eIF2a 和eEF2 蛋白，进而诱导HepG2细胞的凋亡［9］。MA LY等发现油茶皂苷可抑制Jurkat 细胞增殖，阻滞G0/G1 期，其可能的机制是下调p-Bcl-2 和Bcl-2 蛋白的表达水平，上调caspase-3、PARP 和Caspase-9 蛋白的表达水平［10］。另有研究发现：油茶皂苷能降低MCF-7 的增殖率，将细胞周期阻滞于G0/G1 期，其可能的机制是油茶皂苷通过E2F1 介导激活p53 非依赖性途径，p53 非依赖性途径进而诱导MCF-7 细胞的细胞周期阻滞和凋亡［11］。那么油茶皂苷对血管瘤细胞是否有抑制作用呢？

血管瘤主要包括真性血管瘤及血管畸形两大类，是婴儿出生及出生后不久所得的一种先天性良性肿瘤，病因及发病机制未明［12］。目前，临床常用的治疗方式效果一般，且存在一定的不良反应［13］。寻找和研究高效低毒的药物是血管瘤在治疗方面的重要课题之一，本研究发现，油茶皂苷对EOMA细胞体外增殖有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，AO 染色后观察40 mg·L-1油茶皂苷导致细胞生长受到抑制，细胞呈典型的凋亡形态变化现象。查文献可知油茶皂苷在浓度50～200 mg·L-1对人正常肝细胞（LO2）和肾小管上皮细胞（HK-2）有一定的细胞毒性作用［14］。因此细胞凋亡和细胞周期实验采用的浓度是20 mg·L-1及40 mg·L-1油茶皂苷，结果显示，凋亡率分别为9.5%、14.0%，细胞G0/G1 期比例增加，而S期比例减少。

综上所述，油茶皂苷可抑制血管瘤细胞的增殖，其可能的机制是将EOMA 细胞的细胞周期阻滞于G0/G1 期，诱导细胞的凋亡。油茶皂苷有望成为治疗血管瘤的新型药物，但仍需进一步研究。