环状RNA在骨质疏松症中的作用及机制研究进展

董 辉,于 航,王永祥

(1.扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院 骨科,江苏 扬州,225001;2.大连医科大学研究生院,辽宁 大连,116044)

骨质疏松症是一种骨量低下、骨密度降低、骨脆性增加、易发生骨折的全身骨骼代谢性疾病[1],主要由成骨细胞介导的骨形成不足与代偿破骨细胞过度骨吸收导致[2]。随着高通量测序技术的发展和生物信息学的普及，近年来对骨质疏松的研究多集中在基因层面[3]。非编码RNA是临床重点研究对象，其中环状RNA(circRNA)相对于微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)具有更加稳定的自身环状结构，对核酸外切酶介导的降解具有抗性[4-5],且功能复杂，来源广泛，在多种生物体中以时空特异性方式表达[6]。此外，circRNA还参与多种细胞过程，如增殖、迁移和凋亡[7-8],这些特性使得circRNA可能在骨质疏松症的发病机制、早期诊断、靶向治疗等方面发挥巨大的作用。

1 circRNA的生物学特性

circRNA是一种主要存在于哺乳动物细胞质中的由数百个核苷酸组成的非编码RNA，其特征是共价闭合的连续环状结构[9],其3′头和5′尾结合在一起[10]。因剪接结合方式不同,circRNA又分为外显子环状RNA(ecircRNA)、内含子环状RNA(ciRNA)和带有内含子的外显子环状RNA(EIciRNA)3种，其中ecircRNA占大多数，通常由1～5个外显子组成，主要存在于细胞质中，而ciRNA和EIciRNA主要存在于细胞核中[11]。很多研究[12-14]证实circRNA在细胞增殖分化和疾病发生发展过程中起着潜在的调节作用,HUANG Y等[15]发现circRNA具有作为骨质疏松症诊疗生物标志物的巨大潜力。circRNA通过多种机制参与各种生理和病理过程，包括miRNA分子海绵、参与mRNA转录调控及表达、与蛋白相结合发挥蛋白降解功能、直接翻译合成蛋白，目前临床研究主要集中在miRNA分子海绵方面[11]。

2 circRNA的miRNA分子海绵作用

circRNA带有miRNA结合位点，通常充当miRNA分子海绵[16]。研究[17-18]表明，当引入miRNA反应元件(MREs)时,circRNA可能竞争性地与miRNA结合，从而影响剪接或转录来阻止mRNA的翻译并调节基因的表达。

2.1 circRNA与成骨细胞

在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,HAN S等[19]观察到hsa-circ-0076690和Runt相关转录因子2(RUNX-2)的表达逐渐增加，而miRNA-152的表达则随着时间推移逐渐降低。对人骨髓间充质干细胞进行hsa-circ-0076690过表达和敲除处理，实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)结果表明hsa-circ-0076690过表达会导致人骨髓间充质干细胞miRNA-152表达降低,RUNX-2表达增加，而hsa-circ-0076690敲除则表现出相反的结果。此外，成骨相关生物标志物的表达水平和碱性磷酸酶(ALP)活性的检测结果表明,hsa-circ-0076690过表达促进成骨分化。

JI F等[20]观察到hsa-circ-0026827在人牙髓干细胞(DPSCs)来源成骨细胞分化过程中表达显著升高，而敲除hsa-circ-0026827可抑制DPSCs来源的成骨细胞分化。miRNA表达谱分析显示hsa-circ-0026827的下调促进了miR-188-3p的表达。hsa-circ-0026827沉默后,miR-188-3p下调可恢复DPSCs的成骨分化。荧光素酶报告基因检测证实,miR-188-3p是hsa-circ-0026827的靶点,Beclin1和Runt相关转录因子1(RUNX1)是miR-188-3p的下游靶点。miR-188-3p过表达通过靶向调控Beclin1和RUNX1抑制DPSC成骨分化。由此提示,hsa-circ-0026827通过靶向调控Beclin1促进成骨细胞分化，并通过黏附miR-188-3p促进RUNX1信号通路，提示了骨质疏松症的新疗法方向。

在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中,circRNA13685(circIGSF11)的表达显著降低,miR-199B-5p的表达显著增加。对骨髓间充质干细胞的circIGSF11进行siRNA沉默后,miR-199B-5p的表达上调，而且碱性磷酸酶(ALP)和茜素红(ARS)染色强度较阴性对照组增强，促进了成骨细胞的分化[21]。此外还有报道[22]称，miR-199B-5p影响糖原合成酶激酶Gsk-3β/β-catenin途径调节成骨细胞分化。因此,circIGSF11可能通过Gsk-3β/β-catenin途径靶向作用于miR-199B-5p抑制成骨细胞分化。

小脑变性相关蛋白1转录本的反义基因(CDR1as),也被称为miR-7的环状RNA海绵(CIRS-7)[16]。在成骨分化过程中,CDR1as显著上调，而miR-7则下降[23]。CDR1as的低表达和miR-7的过表达都抑制了ALP活性、ARS染色和Runx2的表达。CDR1as竞争性结合miR-7,从而触发生长分化因子5(GDF5)和随后的Smad1/5/8、P38和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化的上调，最终促进成骨分化。除上述相关研究[19-23]外，还有很多研究[24-32]报道了circRNA通过miRNA分子海绵作用对成骨细胞增殖分化产生影响，见表1。

表1 circRNA在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用

2.2 circRNA与破骨细胞

CHEN X等[33]发现，在M-CSF和RANKL诱导骨髓单核/巨噬细胞(BMM)向破骨细胞分化过程中,circRNA-28313表达上调至少3倍。circRNA-28313敲低可显著抑制体外BMM细胞中RANKL+CSF1诱导的破骨细胞分化，同时抑制小鼠体内卵巢切除(OVX)诱导的骨吸收。生物信息学分析已证明miR-195a可能与circRNA-28313和CSF1结合并一起形成circRNA-miRNA-mRNA网络。circRNA-28313通过充当竞争性内源RNA(ceRNA)缓解miR-195a介导的CSF1抑制，从而调节BMM中的破骨细胞分化。因此,circRNA-28313、miR-195a和CSF1形成ceRNA网络以在RANKL+CSF1诱导的破骨细胞分化中起作用，从而影响OVX诱导的小鼠骨吸收。

DOU C等[34]建立的共表达网络中,miR-31与1个下调的circRNA(circRNA-005108)相关。MIZOGUCHI F等[35]的研究中,RANKL刺激下的破骨细胞发育过程中miR-31高度上调，且用miR-31特异性拮抗剂抑制其表达后出现抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色阳性的破骨细胞数量和骨吸收明显减少。破骨细胞的Phalloidin染色显示，抑制miR-31表达后严重损害了破骨细胞外围肌动蛋白环的形成，出现了成簇的小环状足体。在这些破骨细胞中,miR-31靶基因之一的RhoA的表达被miR-31抑制而上调，且用RhoA抑制剂外酶C3干预后破骨细胞数量又得以增长。

LIU S等[36]通过RNA测序和生物信息学分析筛选绝经后骨质疏松症(PMO)患者不同表达水平的circRNA,发现circ-0007059在骨质疏松症患者和人骨髓间充质干细胞破骨分化过程中表达下调。circ-0007059过表达后miR-378表达下调，抑制人骨髓间充质干细胞向破骨细胞的分化，且上调miR-378时可明显降低骨形态发生蛋白2(BMP-2)的表达。双荧光素酶报告基因分析显示circ-0007059直接靶向调控miR-378,而miR-378又靶向调控BMP-2。转染miR-378模拟物可逆转circ-0007059对人骨髓间充质干细胞向破骨细胞分化的影响。这些结果表明,circ-0007059通过miR-378/BMP-2信号通路在破骨细胞形成中发挥重要作用。靶向调控circ-0007059/miR-378/BMP-2轴可能是治疗骨质疏松症的新思路。

MIAO F等[37]证实了circRNA-009934在破骨细胞中高表达，用生物信息学预测circRNA-009934靶向作用于miR-5107,并通过荧光素酶报告实验验证了circRNA-009934与miR-5107的结合关系。circRNA-009934高表达时会抑制miR-5107的表达，同时可显著上调其下游TRAF6的表达，从而促进破骨细胞的形成。因此,circRNA-009934可作为miR-5107的ceRNA来上调TRAF6的表达从而促进骨质疏松。

LIN J B等[38]利用RT-qPCR方法验证了破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中具有差异表达的circRNA,hsa-circ-0002922和hsa-circ-0007710在破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中上调。其中hsa-circ-0002922与hsa-miR-181b-5p结合以调控MAP2K1的表达,hsa-circ-0007710与hsa-miR-197-3p结合以调控MAPK1的表达。相关研究[33-38]报道了circRNA通过miRNA分子海绵作用对破骨细胞增殖分化产生影响，见表2。

表2 circRNA在骨髓单核/巨噬细胞向破骨细胞分化中的作用

3 circRNA作为诊断生物标志物的应用

HUANG Y等[15]通过微阵列分析和定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)发现,circ-0006873和circ-0002060水平在骨质疏松症患者中明显更高。Pearson相关分析显示,circ-0006873和circ-0002060水平与骨质疏松症患者的低骨密度相关。受试者工作特征(ROC)曲线分析表明,circ-0002060对骨质疏松症具有潜在的诊断价值，其敏感性和特异性在骨质疏松症的临床样本中分别为78%和69%。生物信息学、实验分析和疾病模型综合分析结果显示,circ-0002060可作为骨质疏松症潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。

ZHAO K W等[14]对PMO患者与正常人的血液样本进行比较分析，发现381种具有差异表达的circRNAs,其中circ-0001275经qRT-PCR证实在骨质疏松症组内呈高表达，在非骨质疏松症组内呈低表达。回归分析表明circ-0001275与骨密度值具有高度相关性,ROC曲线下面积为0.759,敏感度和特异度分别为66.4%和85.3%。因此,circ-0001275 可作为绝经后骨质疏松症的新型诊断生物标记物。

XIANG S K等[39]评估了hsa-circ-0001445作为PMO患者血浆生物标志物的潜力。该研究采用qRT-PCR检测健康者、骨质减少(OPE)患者和PMO患者血浆中hsa-circ-0001445的表达水平，结果发现PMO患者血浆hsa-circ-0001445表达水平显著低于OPE患者和健康对照者。hsa-circ-0001445表达与T-score呈正相关，与β胶原降解产物(β-CTx)呈负相关。PMO患者接受抗骨质疏松治疗后血浆中hsa-circ-0001445表达明显上调，提示血浆hsa-circ-0001445可能是一种新的潜在的PMO诊断生物标志物。

4 结 语

骨吸收和骨形成之间的平衡维持了骨的稳态，当平衡打破就会导致骨质疏松[40]。目前骨质疏松症的临床研究主要集中于成骨细胞和破骨细胞方面，而其发病机制的研究尚未取得较大进展。circRNA是一类具有环状结构的新型非编码RNA,在细胞生长、信号转导和生理病理反应等多种生物学活动中发挥着重要作用[41],同时参与调控成骨或破骨形成过程，也可以调节成骨细胞和破骨细胞之间的平衡[42]。本文重点综述了circRNA在骨质疏松症中的表达模式及其可能机制，相信未来其可作为骨质疏松症的诊断标志物，并通过合适的载体作为核酸药物，靶向作用于致病基因来延缓甚至扭转骨质疏松进程。