2型糖尿病患者GCKR基因多态性及巨噬细胞STAT3蛋白表达的研究

褚 璐,任建华,于晓忠

(开滦总医院赵各庄医院，河北 唐山063101)

2型糖尿病(T2DM)占全部糖尿病患者数的90%左右，是由于机体存在胰岛素抵抗(IR)导致血糖升高而形成的疾病[1-4]。T2DM的发病机制仍不清楚，不过其发病具有很强的家族聚集性。GKRP是糖异构酶家族成员，为一种不耐热的化学分子蛋白质。GCKR可与肝脏中的葡萄糖激酶(GCK)结合成GKRP-GCK复合物，维持葡萄糖稳态，调节肝脏葡萄糖代谢和胰岛素释放，抑制GCK的活性[5-6]。GCKR的基因多态性位点rs780094的T等位基因与T2DM 发病风险的降低和血糖水平的降低有关[7]。巨噬细胞是机体发挥免疫调节的重要细胞之一，在外在因素的刺激下可分泌多种分子诱导免疫耐受，从而诱发相关疾病的发生[8]。信号传导和转录激活因子(STAT)是一种脱氧核糖核酸结合蛋白，存在于胞质中，能进入细胞核与DNA结合，从而发挥调控基因转录的功能[9]。STAT3是STAT3蛋白家族的重要成员，阻断小鼠巨噬细胞的STAT3可刺激机体产生高水平的炎性细胞因子，发挥促炎作用[10-11]。本文通过检测T2DM患者GCKR基因多态性及巨噬细胞STAT3蛋白表达情况，希望为T2DM的免疫治疗寻找新的途径、靶点和药物提供参考。现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

采用回顾性的研究方法，研究时间为2014年5月到2018年2月，选择在开滦总医院赵各庄医院内分泌科进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)筛查的健康人156例(对照组)、T2DM患者56例(T2DM组)与血糖调节受损(IGR)患者120例(IGR组)，纳入标准：医院伦理委员会批准了此次研究；无严重的急慢性疾病、肾病及其他严重疾病；临床资料完整；年龄20-75岁；患者签署了知情同意书。排除标准：TIDM及继发性糖尿病者；心、肝功能不良者；妊娠、哺乳期者；患急性感染性疾病者；肿瘤、心脑血管意外患者。

1.2 GCKR基因多态性检测

所有入选者在晨起空腹取舒适体位，肘前静脉无菌采血5-8 ml后，采用QIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒提取外周血淋巴细胞的DNA。使用DNA MAN软件设计待测多态性位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，rs780094 引物序列为：正向引物：5′-ACGTTGGATGAGGGCCCCAGTT-TTTTAGAC-3′，反向引物：5′-ACGTTGGATGCCCGGCCTCAACAAATGTAT-3′。探针和引物由大连TAKARA公司设计和提供，严格按照实验说明进行操作。5 μl反应体系：2×Mix 2.5 μl，40×Mix Kit 0.115 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 1.385 μl。PCR条件：40个循环，95℃ 10 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min。扩增产物片段长度为186 bp。

1.3 Western blot检测巨噬细胞STAT3蛋白表达情况

从患者的肘前静脉血中收集单核细胞，与巨噬细胞进行共培养，37℃孵箱共培养48 h后收集细胞。裂解细胞，离心取蛋白，采用BCA法定量蛋白浓度，上样SDS-PAGE胶，转膜后，一抗稀释兔抗鼠Stat3抗体(×1000，Santa Cruz公司)与鼠抗鼠β-Actin抗体(×1000，Santa Cruz公司)，使用人HRP标识的二抗稀释液(×10000，北京中杉金桥公司)，放入自动显像系统，曝光读取。

所有入选者的血糖、血脂指标由检验科统一检测(奥林巴斯全自动生化分析仪)，同时记录所有入选者的性别、年龄、体质量指数等资料。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 基本特征对比

三组入选者的性别、年龄、体质量指数等对比差异无统计学意义(P>0.05)，T2DM组的空腹血糖、LDL-C、TG值显著高于对照组，HDL-C和TC值低于对照组，T2DM组的空腹血糖高于IGR组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 GCKR基因型与等位基因分布

三组入选者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡(P>0.05)，rs780094位点的三种基因型CC、CT、TT和等位基因C、T在T2DM组、对照组、IGR组之间的频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 三组入选者的基本特征对比

表2 三组入选者的rs780094位点基因型及等位基因分布对比(n)

2.3 STAT3蛋白表达量对比

T2DM组的巨噬细胞STAT3蛋白相对表达量高于对照组和IGR组，IGR组也高于对照组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 三组STAT3蛋白表达量对比

2.4 相关性分析

采用二元logistics回归模型，在校正了年龄、性别、体质量指数、血糖、血脂等混杂因素后，与C等位基因相比，T等位基因入选者T2DM患病OR值为0.992；与CC 基因型相比，携带CT、TT、CT+TT基因型的入选者T2DM患病OR值为0.872、0.983和0.911。见表3。

在T2DM患者中，在校正了年龄、性别、体质量指数、血糖、血脂后，GCKR rs780094的CT、TT基因型患者与CC基因型患者相比，T等位基因患者与C等位基因患者相比，巨噬细胞STAT3蛋白表达量显著下降(P<0.05)。见表4。

表3 不同GCKR基因型入选者的T2DM患病风险

表4 T2DM患者GCKR基因型与巨噬细胞STAT3蛋白表达的相关性(n=56)

3 讨论

全基因组关联研究显示T2DM的易感候选基因接近300种，但是尚无一种或几种基因能解释T2DM遗传变异情况[12]。全基因组扫描显示GCKR基因长27kb，定位于染色体2p23.2-3，包含19个外显子和18个内含子。血糖降低可让GKRP与GCK特异性地结合，使GCK在细胞核内保持失活状态，促使血糖升高[13]。血糖升高可使GCK-GKRP 解离，促进肝糖原合成，导致血糖降低。特别是过量表达的GKRP与更多的GCK 于核内结合，可发挥调节糖代谢的作用[14]。GCKR的基因多态性位点rs780094，早期研究显示GCKR rs780094位点的T等位基因与T2DM发病风险有一定的相关性[15]。本研究显示两组入选者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡(P>0.05)，rs780094位点的三种基因型CC、CT 、TT和等位基因C、T在T2DM组、对照组、IGR组之间的频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。相关研究显示白种人群中，rs780094 T等位基因降低了T2DM发病风险；非裔人中rs780094 T等位基因与T2DM的相关性较小[16-17]。本次研究也表明两者无显著相关性，可能与我国人群遗传因素、生活方式、饮食习惯及其交互作用有关。不过本研究显示T2DM组的空腹血糖、LDL-C、TG值显著高于对照组，HDL-C和TC值低于对照组，T2DM组的空腹血糖高于IGR组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)。从机制上分析，GCK水平的升高伴随着游离型和结合型的GCK的活性均升高，可使肝脏葡萄糖酵解通量增加、葡萄糖的利用增加，导致脂肪酸合成酶的表达上调，促进了糖原的合成，并且促进脂肪酰辅酶A转变为LDL-C和TG[18]。为此有研究表明GCKR基因rs780094的T等位基因具有对空腹血糖浓度降低和对TG浓度升高的作用[19-20]。

STAT3的酪氨酸残基磷酸化可形成同源或异源二聚体，转移到细胞核内，调节与诱导基因表达[21]。巨噬细胞的STAT3激活能增加白介素-10的分泌而诱导免疫抑制，特异性地阻断小鼠巨噬细胞的STAT3，能促进机体产生高水平的炎性细胞因子，刺激细胞毒T淋巴细胞的增殖。STAT3也可参与调节多种细胞凋亡抑制基因的表达，STAT3的活化能诱导其靶基因Survivin的表达，发挥抗肿瘤细胞凋亡的作用[22]。本研究显示T2DM组的巨噬细胞STAT3蛋白相对表达量高于对照组和IGR组，IGR组也高于对照组(P<0.05)。相关研究也表明酪氨酸磷酸化可募集胞浆内的STAT3，从而诱发炎症性疾病的发生[23]。

GCK是葡萄糖氧化过程中的限速酶，能感受葡萄糖水平，参与调控肝脏糖原合成和葡萄糖异生，调节胰岛素分泌。GCKR能竞争性抑制葡萄糖与GCK 结合，从而抑制GCK 活性，使血糖水平升高。本研究二元logistics回归模型显示与C等位基因相比，T等位基因入选者T2DM患病OR值为0.992；与CC 基因型相比，携带CT、TT、CT+TT基因型的入选者T2DM患病OR值为0.872、0.983和0.911。当前也有研究表明rs780094AA基因型在T2DM患者和代谢综合征患者中空腹血糖水平较其他基因型者低[24]。

巨噬细胞可以分泌多种炎性因子，其中JAK-STAT途径目前被认为是细胞因子信号转导的主要途径，可参与调节细胞增殖、分化、凋亡等多种生命活动。STAT3蛋白不仅对于肿瘤细胞的直接作用，还能在肿瘤微环境中对血管新生以及免疫逃避起到抑制作用。本研究显示GCKR rs780094的CT、TT基因型患者与CC基因型患者相比，T等位基因患者与C等位基因患者相比，巨噬细胞STAT3蛋白表达量显著下降(P<0.05)。GCKR rs780094基因型对巨噬细胞STAT3蛋白表达量的影响机制还不明确。有研究显示，STAT3是炎性反应的调节因子，炎症因子也通过抑制巨噬细胞的免疫功能，特别是能抑制巨噬细胞的抗原呈递能力。GCKR rs780094基因多态性可激活交感神经系统，从而减低STAT3活化状态，使巨噬细胞增殖活性降低[25]。

综上所述，T2DM患者可表现为GCKR基因多态性，可导致T2DM的患病风险发生变化，与巨噬细胞STAT3蛋白表达有显著相关性，从而调节T2DM的发生与发展。