新型冠状病毒(SARS-CoV-2)实验诊断进展

黄一博，刘传志，侯 玥

(长春理工大学生命科学技术学院,吉林 长春130022)

目前，一种新型病毒引起的传染性肺炎疾病正在全球爆发。事件中涉及的病毒被确认为第七种冠状病毒，成为本世纪第三种人畜共患的冠状病毒，对人类健康构成了严重威胁。世界卫生组织(WHO)将病毒引起的疾病正式命名为冠状病毒病2019(COVID-19)[1]。截至2020年9月，与COVID-19相关的确诊病例接近3300万，给全球人类健康带来巨大挑战和严重经济损失[2-6]。

SARS-CoV-2感染的不确定潜伏期和非特异性症状流行情况更加严重[7-9]。在缺乏有效的COVID-19抗病毒治疗方法和疫苗的情况下，特别需要高通量、操作简便的快速检测方法，可在早期灵敏地检测SARS-CoV-2感染，以应对不断发展的冠状病毒爆发并预防和控制流行[10]。本文描述了目前SARS-CoV-2感染的实验诊断进展，希望有助于COVID-19感染快速准确的实验室诊断和治疗。

1 SARS-CoV-2生物学特性及感染机制

冠状病毒(CoVs)是一种具有正单链RNA基因组的包膜病毒，是目前发现的最大的RNA病毒基因组[11-12]。在SARS-CoV-2出现之前，MERS-CoV和SARS-CoV引起了大范围爆发，感染后会有明显的症状，曾出现过大的爆发和致死,但与SARS-CoV-2相比，SARS-CoV-2表现出了更强的传染性，造成了更严重的后果[12]。

SARS-CoV-2是β-冠状病毒属亚属sarbecovirus，血管紧张素转换酶2(ACE2)作为细胞受体是SARS-CoV-2与SARS-CoV同一进入细胞结合位点，从而感染人类[6]。SARS-CoV-2的直径介于50至200 nm之间，由29 881 bp的基因组成[13]。SARS-CoV-2基因组至少有四个结构编码蛋白，分别称为核衣壳(N)，刺突(S)，包膜(E)和膜(M)。N蛋白保留病毒基因组，S蛋白、E蛋白和M蛋白构成病毒包膜。其中，S蛋白介导病毒进入宿主细胞，并在一定程度上确定病毒感染过程中的宿主范围[14]。

SARS-CoV-2与大部分RNA病毒最大的区别是SARS-CoV-2对宿主细胞的选择和与宿主细胞膜的融合方式，这两点归结于一种关键的蛋白——刺突蛋白。正常情况下，三个刺突蛋白组成一个S蛋白三聚体，这些结构分散着镶嵌在病毒的表面，形成一个个“冠状”结构，这也是冠状病毒得名的原因所在。

刺突蛋白可分为两个部分：S1和S2。S1位于远病毒端(蛋白质的N端)，含有一个关键的受体结合区(RBD)，负责跟宿主细胞表面的特定蛋白质(称为受体)进行特异性结合与识别[15]；S2位于近病毒端(蛋白质的C端)，含有一个融合肽区(FP)，对病毒包膜与宿主细胞膜融合至关重要。两者之间还拥有一个酶切位点，称为分开点。因为S1和S2的功能是依序进行，所以S1执行功能后必须在分开点与S2断开，才可保证S2功能的完成。随后，作为病毒遗传物质的正链RNA释放到宿主细胞内，借助宿主的翻译机制、合成原料等进行病毒繁殖，条件成熟后释放出大量子代SARS-CoV-2，开启对宿主细胞的新一轮感染。

人类感染SARS-CoV-2主要途径是通过呼吸道飞沫、接触和粪便传播。SARS-CoV-2的估计感染率(R0)从2.2到5.7[16-17]，而报告的SARS-CoV的R0约为3[18]。据推测，原发性病毒复制发生在上呼吸道的黏膜细胞(咽和鼻腔)，并在下呼吸道和胃肠道的黏膜细胞中繁殖[19-20]。Neeltje等揭示在组织培养实验中SARS-CoV-2气溶胶仍然具有传染性，并且在3小时的观察期内感染性仅略有下降[21]。最近的一些研究报道，在粪便样本中检测到SARS-CoV-2[22-23]。尽管这些证据表明SARS-CoV-2也可能是通过粪-口途径传播的肠道病毒，但这些发现是基于极少数患者的情况，因此有待进一步研究。

2 SARS-CoV-2的实验诊断

2.1 SARS-CoV-2检测的标本种类

在实验诊断过程中，标本的采集是实验诊断COVID-19的关键步骤。目前可采集的标本包括呼吸道标本，血液标本，粪便及尿液标本[2,22-28]。其中，呼吸道分泌物是最简便和常用的诊断标本。

ACE2主要分布在II型肺泡上皮细胞中[29]，表明下呼吸道标本(包括痰液，气管吸出物)可能含有较高的病毒RNA量。Yu等比较了127名确诊或疑似COVID-19患者的痰液，咽拭子和鼻拭子的平均病毒载量。研究发现，痰中的平均病毒载量(17429±6920拷贝/测试)明显高于鼻拭子(651±501拷贝/测试)和咽拭子(2552±1965拷贝/测试)[27]。临床观察表明，在感染期间，在COVID-19患者的唾液样本中经常检测到SARS-CoV-2，通过RT-PCR在12名COVID-19患者中的11名唾液样本中鉴定出SARS-CoV-2。住院后，连续唾液的病毒载量监测总体呈下降趋势[30-31]。

除了最常见的呼吸道标本，非呼吸道标本中也经常检测到SARS-CoV-2。据报道，从1名确诊的COVID-19患者的尿液样本中检测到SARS-CoV-2[32],通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测到60名COVID-19患者中有2名眼泪和结膜拭子样本SARS-CoV-2呈阳性[33]。

2.2 SARS-CoV-2的核酸检测

依据公开数据库发布的SARS-CoV-2基因组，对目标基因设计的特异性引物和探针可以实现COVID-19的实验室诊断。到目前为止，用于检测SARS-CoV-2的基因靶标包括N，E，S，RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)和开放阅读框架1ab(ORF1ab)基因测试[34]。

核酸检测方法包括RT-PCR、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)技术等。其中，实时定量RT-PCR(qRT-PCR)作为SARS-CoV-2鉴定的金标准，也是世界卫生组织(WHO)推荐的常规确认试验[35-36]。但对实验场所及人员要求高、耗时长，检测人员感染风险高，检测结果受样本质量、实验条件及人员操作等因素影响较大，特别是假阴性问题，使核酸检测的作用一度被质疑[34]。SARS-CoV-2实验室诊断方法的优缺点，见表1。

表1 SARS-CoV-2实验室诊断方法的优缺点[37]

2.2.1实时定量RT-PCR 世卫组织网站提供了几种qRT-PCR方案，用于检测不同国家的SARS-CoV-2[34]。不同机构中SARS-CoV-2的RT-PCR测试/引物显示见表2。美国疾病预防控制中心(CDC)成立了一个RT-PCR小组，专门检测SARS-CoV-2和通用检测SARS样β-CoV。为N基因设计了三套不同的引物，一套引物/探针普遍用于检测所有β-CoV，而另两套则特异性地鉴定SARS-CoV-2。对于所有三个目标，COVID-19的确认都必须为阳性[38]。德国Charite开展了两种用于检测SARS-CoV-2，SARS-CoV和蝙蝠样β-CoV的RdRP和E基因的核酸测试。两项检测均为阳性可进入检测的下一步，即针对RdRP基因的SARS-CoV-2特异性RT-PCR检测[39]。

虽然各相关机构对SARS-CoV-2测试制定了不同的方案，但基于不同目标的核酸测试结果是否具有可比性仍然不明确。Chantal等使用了从COVID-19患者中分离的RNA转录本来比较分别在美国，德国，香港和中国建立的四种qRT-PCR分析的灵敏度[40]。研究发现，在qRT-PCR测试中使用的所有引物探针组中都可以检测到SARS-CoV-2，但在检测限和识别病毒载量较低的阴性和阳性的能力方面发现了显着差异。在E-Sarbeco(德国)，2019-nCoV_N1(美国)和HKU-ORF1(香港)中发现了灵敏度最高的引物探针组，而在RdRP-SARSr(德国)中发现了最低的灵敏度，这可能与反向引物的错配有关[40]。此外，Konrad等在德国使用COVID-19患者的鼻咽拭子或痰液样本比较了不同PCR系统和商业试剂中的qRT-PCR测试[41]。当使用相同的引物和探针时，还观察到了不同PCR系统之间分析灵敏度的差异。他们发现，使用单步qRT-PCR系统时，E基因靶标比RdRP靶标更敏感。然而，E基因靶标的高背景妨碍了对测试的清晰评估，并且进一步优化E基因测定法可以提高灵敏度。

表2 不同机构中SARS-CoV-2的RT-PCR测试/引物[37]

2.2.2巢式RT-PCR 巢式RT-PCR分析法已被证明适用于检测疾病早期的低拷贝数SARS冠状病毒[42]。在疫情爆发的早期，日本已验证了通过巢式RT-PCR 检测SARS-CoV-2的方法[43]。最近，日本设计了一种用于靶向SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的一步式巢式RT-PCR(OSN-qRT-PCR)分析。该测定法的灵敏度为1个拷贝/测试，比商业qRT-PCR测定法(10个拷贝/测试)高10倍。在181份临床样本中，通过OSN-qRT-PCR确认了14份qRT-PCR阴性的样本。另外，通过OSN-qRT-PCR证实7例在灰色区域中qRT-PCR阳性的样品为阳性[44]。与qRT-PCR试剂盒相比，巢式RT-PCR分析显示出更高的灵敏度和特异性。但是，巢式RT-PCR可能导致实验室交叉污染，假阳性结果增多。

2.2.3液滴数字PCR(ddPCR) 液滴数字PCR被证明检测SARS-CoV-2时具有较高的灵敏度和准确性[45]。Suo等使用中国疾病预防控制中心针对ORF1ab或N基因发布的相同引物/探针组，分析了ddPCR与qRT-PCR相比用于SARS-CoV-2 RNA检测的可行性。ddPCR证实26例RT-PCR阴性的COVID-19患者为阳性。灵敏度和准确性从RT-PCR的40%和47%分别提高到ddPCR的94%和95%。出院后5-12天内，ddPCR显示有6/14例患者(42.9%)呈阳性[45]。研究表明，ddPCR可以大大减少qRT-PCR引起的假阴性结果。该团队使用相同样品和条件的8个引物/探针组进一步严格分析了ddPCR和qRT-PCR的性能。结果显示，qRT-PCR中使用的所有8种引物/探针均无法在低病毒载量(10-4稀释度)下明显区分阳性和阴性。发现美国CDC-N1，N2和中国CDC-N引物/探针集的qRT-PCR测试的假阳性结果。相反，ddPCR的整体性能明显优于qRT-PCR，特别是对于低病毒载量的样品[46]。

2.2.4环介导的等温扩增 LAMP技术具有在固定温度下快速扩增的优势，在快速诊断冠状病毒中具有重要意义。Zhang等设计了针对SARS-CoV-2的ORF1a和N基因5'区域的完整LAMP引物，通过与RT-PCR方法进行视觉比色分析。7个样品中有6个显示出可见的颜色变化，表明扩增为阳性，而1个样品则保持粉红色并确认为阴性。比色分析的RT-LAMP在一定范围的Cq值上与RT-PCR结果100%一致，并且无需使用复杂的仪器即可在现场检测，并与现场设置RT-PCR检测结果相同[47]。

2.3 SARS-CoV-2的抗原检测

SARS-CoV-2是由多种病毒编码蛋白质组成的，包括S，N，E和M蛋白质。在这些蛋白质中，S和N是SARS-CoV-2抗体的两个主要抗原靶标[48]。S蛋白可分为两个独立的多肽，即S1和S2[49]。虽然S蛋白对于病毒进入细胞至关重要，存在于病毒表面，但N蛋白是与RNA相互作用且表达最丰富的蛋白，比S蛋白更保守[49]。在S蛋白中，S1的保守性较低，对SARS-CoV-2的特异性更高，表明S1的特异性比全长S或S2的抗原更重要，是COVID-19血清学检测的靶标[49]。此外，S1蛋白的RBD结构域比S1或全长S更保守，并且与其他冠状病毒的交叉反应性要低[50]。

免疫层析法是检测SARS-CoV-2抗原最常用的方法[51]。Lorena等比较了四种免疫层析法抗原检测试剂盒(RapiGEN，Liming bio，Savant和Bioeasy)检测SARS-CoV-2的情况，并显示出显著差异的测试性能。在这些测试中，Bioeasy测试显示出最高的准确度，为89.2%，而Liming生物测试由于性能不佳而在测试过程中被中止。其他试剂盒的敏感性范围从Savant分析的16.7%到Bioeasy测试的85%[51]。

与免疫色谱法灵敏度相比，目前研究出基于高灵敏度SARS-CoV-2生物传感器已在检测中进行了应用测试。Sophie等开发了一种便携式的基于细胞的快速生物传感器，带有S1抗体，可用于检测SARS-CoV-2 S1蛋白[52]。生物传感器可以在3分钟内完成检测，检测限为1 fg/mL，线性响应范围为10 fg至1 μg/mL。

2.4 SARS-CoV-2的抗体检测

虽然核酸检测是确诊病毒感染的“金标准”，但由于标本采集部位、时间、试剂质量、实验室质量管理体系等因素的影响，核酸检测的误差无法完全避免。抗体检测可以作为对核酸检测的有效补充[53]。当病毒感染人体后，因抗原刺激作用，人体会产生特异性抗体，可通过检测人体内特异性抗体的存在来间接判断是否感染病毒。我国《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》明确将抗体检测结果纳入确诊病例的诊断标准，以及疑似病例的排除标准[54]。

抗体检测的样本主要是血清、血浆或全血，检测技术主要分为3类：化学发光法、胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附试验。

2.4.1酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是最常用的一种免疫分析方法。Kohmer等比较了Vircell COVID-19 IgG(重组N蛋白)和Euroimmun SARS-CoV-2 IgG(重组S蛋白)在SARS-CoV-2感染不同阶段的检测性能。PCR确认的COVID-19后第5-9天，Vircell ELISA的敏感性为70.6%，Euroimmun ELISA的敏感性为58.8%。在确认后的10-18天内，Vircell ELISA的敏感性为100%，Euroimmun ELISA的敏感性为93.8%[55]。同样，Liu等评估了两种基于SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的ELISA试剂盒，用于检测IgG和IgM抗体。该团队在疾病发作后6-10天使用基于S蛋白的ELISA测试在不到60%的样本中检测到SARS-CoV-2 IgG抗体，并且在发病后16到20天后样本的敏感性提高到> 90%[56]。此外，S蛋白的IgG和IgM ELISA的敏感性分别为74.3%和77.1%，N蛋白的IgG和IgM ELISA的敏感性分别为70.1%和68.2%。S蛋白和N蛋白的ELISA测试的总体灵敏度分别为82.2%和80.4%。与N蛋白的ELISA相比，S蛋白的ELISA具有更高的敏感性[56]。

2.4.2化学发光免疫测定(CLIA) 化学发光免疫测定技术是采用发光物质作为示踪标记物的原理检测抗原(或抗体)的分析方法。CLIA的优势最近在SARS-CoV-2的检测中得到了证明[57]。自COVID-19疫情出现以来，已有SARS-CoV-2血清IgM和IgG抗体CLIA检测试剂盒在临床上应用报道[58]。胡纪文等采用37例临床确诊新型冠状病毒肺炎患者恢复期血清样本100例对照患者血清样本，对不同厂家的SARS-CoV-2血清IgM和IgG抗体CLIA检测试剂盒进行了评估，结果发现对于IgM抗体检测，试剂A和试剂B具有非常好的检测性能，尤其是试剂B性能最优，临床敏感度为56.76%，临床特异度为99%；对于IgG抗体检测，三种试剂均具有非常好的检测性能，三种试剂的临床特异度均为97.00%，而试剂C的临床敏感度最高，为97.29%。证明CLIA试剂盒检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体均具有一定的临床敏感度和特异度[59]。

2.4.3免疫层析测定 免疫层析测定法具有检测样本采集易标准化(全血样本)、操作简单、报告时间快(约15 min)的特点，适用于快速筛查，特异性较高，无需特殊设备(目视判定结果)，有助于SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体的定性或半定量检测[60]。

Isabel等评估了128名COVID-19患者的抗体使用三种用于检测SARS-CoV-2 IgG和IgM的免疫层析试剂(Avioq，QuickZen和LaboOn Time)和两种定量自动免疫检测(Euroimmun IgG/IgA ELISA检测和MaglumiTMIgG/IgM CLIA检测)。该测试在阴性对照样品分析中的特异性为100%。三种免疫层析测试的总体灵敏度约为70%，未观察到显著差异。在症状发作后的第二周内，所有测试的敏感性都提高了，并且在14天后所有测试的敏感性都达到了相似的水平(91%至94%)[61]。

张稳健等报告了SARS-CoV-2病毒IgM/IgG抗体胶体金免疫层析法检测效果及临床应用价值。其中新冠肺炎患者114例，SARS-CoV-2核酸检测阴性的正常人138例及其他发热伴呼吸道症状病例64例,并对诊断病例的病毒核酸、IgM/IgG抗体的时间分布进行了分析。结果SARS-CoV-2核酸检测阳性病例为105例,胶体金法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体的敏感性分别为76.2%和86.6%，抗体阳性总体符合率为96.1%；核酸、抗体均为阴性者为73例，总体符合率为100%。健康人和其他发热病人中，IgM和IgG检测特异性分别为99%和98%。研究显示，胶体金免疫层析法检测SARS-CoV-2抗体有较好的敏感性及特异性,在新冠肺炎疫情防控中具有一定的应用价值[62]。

Nicol Thomas等对293例新冠肺炎患者进行CLIA、ELISA和LFIA分析发现：CLIA、ELISA和LFIA对IgG的总体敏感性相当(约80%)，在所有检测患者症状出现后14 d以上，检测免疫球蛋白的敏感度为100.0%。与ELISA (95.8%)相比，CLIA和LFIA对IgG的总体特异性更高(>98%)。ELISA检测IgA和LFIA检测IgM的特异性分别为78.9%和95.8%[63]。

上述三种SARS-CoV-2血清学检测方法各有优劣，酶联免疫吸附技术检测成本低，无需测量仪可采用酶标仪定量分析，但缺点是操作步骤繁复，检测范围受底物反应影响大；胶体金免疫技术检测成本低，无需测量仪器，技术操作简单，可以快速出检测结果，不足之处在于不可定量分析，标记蛋白质团聚易造成假阳性；化学发光免疫技术灵敏度较高，检测范围宽，可定量分析，可实现大量快速检测，但需要分析仪进行检测，检测成本相对较高[64]。

3 总结与展望

目前，COVID-19在全球的流行愈演愈烈，严重威胁人类健康。快速和早期的实验室诊断对于诊断感染和控制传播至关重要。RT-PCR作为SARS-CoV-2鉴定的金标准测试，得到WHO的确认。RT-PCR设计虽然选择病毒基因组的保守区域，但由于RNA病毒大量的遗传变异，引物、探针和靶序列之间的错配可导致检测性能降低和假阴性结果。检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体，作为分子诊断方法的补充，抗体检测可以帮助调查正在爆发的疫情以及对发作率或爆发程度进行回顾性评估。然而，由于耗时、昂贵的设备和生物安全要求，针对分子和免疫学测定均不适用于即时诊断。即时检验不仅适用于临床实验室，而且还可以由受过训练的非实验室人员在患者现场(例如医师办公室或急诊室)进行检测，从而使SARS-CoV-2的诊断测试更接近于实验室。免疫层析测定法是即时检测的血清学检测方法，但是商品试剂的性能仍有待提高。总之，血清学检测可以作为病毒传播的指标，而RT-PCR检测可以显示当前感染该疾病的患者，因此，需要结合分子和血清学检测来提高COVID-19的诊断准确性。