抗击新型冠状病毒肺炎中医药研究基于网络药理学探讨厚朴-广藿香治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制

李胜，昌强，李彦志，李莞婷，兰芯，吴心悦，吕光华，龙飞▲

(1.成都中医药大学 药学院 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137；2.成都中医药大学 民族医药学院，四川 成都 611137)

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起[1]。具有传播迅速广泛、传染性强、易感染的特点[2]。截至2020年5月11日24时我国累计报告确诊病例82 919例，全球累计确诊超过400万余例[3]。该病临床以发热、干咳、乏力为主要表现，轻型仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍及多器官功能衰竭，甚至死亡。其中重型危重指标包括外周血炎症因子如IL-6、反应蛋白进行性上升等[4]。国内在新冠肺炎救治过程中，中医药发挥了独特的优势，中医药参与的治疗超过了90%。据相关文献报道以2020年2月19为节点，国内共发布52张中医药防治新冠肺炎不同时期诊疗方案代表方[5]。

厚朴-广藿香药对多见于湿滞中焦证。广藿香，性微温，味辛，归脾、胃、肺经，具有化湿解暑、止呕的功效，为芳香化湿浊要药，《本草图经》言其“治脾胃吐逆，为之要药”；厚朴，性温，味苦、辛，归脾、胃、肺、大肠经，具有行气消积、燥湿平喘的功效，为消除胀满之要药，《别录》有言“消痰下气，治霍乱及腹痛胀满”[6]。两者配伍化湿醒脾、和胃止呕、行气除满。厚朴-广藿香药对常见于《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》所列出的中医药治疗方案中，两药配伍主要用于临床表现为轻型、普通型、重型及恢复期中相关方剂(寒湿郁肺方、寒湿阻肺方、湿热蕴肺方、湿毒郁肺方)[7]。此外有研究指出，广藿香在新冠肺炎防治中药方剂中出现的频率最高，超过30%，尤其是在预防，医学观察期和轻症期阶段的占比最高，且厚朴配伍广藿香为高频使用中药配伍药对[5]。相关学者认为新冠肺炎属于中医学“寒疫”范畴,主要病位在肺,其次在卫表、脾胃[8]。《尚篇·详论温疫以破大惑》中指出“中焦为阴阳交界，凡清浊之邪必从此区分，甚者三焦相涸”。笔者在药物归经及药对选用频率的启示下，选择厚朴-广藿香药对探讨其在治疗“寒湿疫”中的作用。

本研究基于网络药理学的研究方法，筛选厚朴-广藿香的活性化合物，运用TCMSP、BATMAN-TCM、GeneCards 、Uniprot等数据库收集厚朴-广藿香及COVID-19相关疾病靶点，构建“药物-活性成分-疾病靶点”网络、靶点蛋白间的相互作用关系网络、进而对潜在靶点功能信号通路等进行多维度可视化处理，从分子水平探讨厚朴-广藿香治疗COVID-19的作用机制，为进一步研究和新药开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 厚朴-广藿香活性成分的筛选及作用靶点的预测

本研究通过TCMSP平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[9]，以“厚朴”“广藿香”为检索关键词，满足口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18条件进行筛选，并利用中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),满足Score cutoff=20，P Value Cutoff=0.01条件和查阅相关文献进行检索补充获取厚朴-广藿香的有效化合物及其作用靶点。将得到符合筛选条件的活性成分靶点信息通过Uniport数据库中UniProtKB搜索功能，输入蛋白名称，并去除非人源的靶点基因使基因名标准化(BATMAN-TCM数据库获得的标准基因不作处理)。

1.2 COVID-19相关靶点的预测

借助GeneCards数据库(https：//www. genecards.org/)，以“novel coronavirus”为关键词进行检索，得到治疗新型冠状病毒(COVID-19)肺炎疾病作用靶点。

1.3 厚朴-广藿香治疗COVID-19潜在靶点的预测

借助ImageGP在线数据分析平台(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)将1.1中所得到的药物作用靶点与1.2中COVID-19肺炎疾病可能作用靶点绘制韦恩图，二者的交集为治疗COVID-19潜在作用靶点。将搜集得到的有效化合物潜在作用靶点及疾病靶点通过Excel整理后导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-活性成分-疾病靶点”网络。

1.4 PPI网络的构建和核心靶点的筛选

将1.3中得到的交集靶点数据导入STRING数据库(https://string-db.org/)，设定物种来源“Homo sapiens”，进行蛋白与蛋白的相互作用分析，得到交集靶点PPI信息。再利用Cytoscape3.7.2软件绘制相互作用网络，利用 Network Analyzer 对该蛋白互作网络进行分析，计算网络中每个节点(靶点蛋白)度值(degree)，按照度值大小进行网络拓拔分析。

1.5 GO富集分析与KEGG通路分析

将1.4中的交集靶点数据导入Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，设定Min Overlap=3，P Value Cutoff=0.01，Min Enrichment=1.5，进行GO生物学过程富集分析和KEGG信号通路富集分析。对于满足条件的富集分析结果借助ImageGP在线数据分析平台(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)进行可视化处理。

2 结果

2.1 厚朴-广藿香活性成分及作用靶点

共检索得到厚朴-广藿香活性成分15个，其中厚朴4个，广藿香11个，广藿香11个活性成分中2种活性成分无相应作用靶点，将通过TCMSP数据库获得的两者活性成分靶点分别借助UniProt数据库转化得到标准基因名，结合BATMAN-TCM数据库及相关文献共计获得227个作用靶点(去除重复值及非人源的靶点基因)，厚朴-广藿香活性成分OB、DL值及药物作用靶点个数详见表1。

表1 厚朴-广藿香活性成分OB、DL值及药物作用靶点个数

2.2 厚朴-广藿治疗COVID-19的潜在作用靶点预测

通过GeneCards数据库共检索到350个与COVID-19疾病相关的靶点，借助ImageGP在线数据分析平台与2.1中的得到的227个活性成分作用靶点进行映射，映射后得到共同靶点47个，将二者绘制成维恩图。47个交集靶点即为治疗COVID-19的潜在作用靶点。

图1 厚朴-广藿香活性成分作用靶点和COVID-19疾病靶点维恩图

2.3 “药物-活性成分-疾病靶点”网络分析

“药物-活性成分-疾病靶点”网络共包含55个节点(其中药材节点2个，潜在药物活性成分6个，潜在作用靶点47个，56条边。圆形代表药材，三角形代表厚朴-广藿香中活性成分(黄色为广藿香，紫色为厚朴)，菱形代表潜在作用靶点，节点间连线越多说明二者之间对应关系密切，在整个网络中可能起到枢纽的作用，在图2中MOL 000098-槲皮素、MOL 005916-葛花苷元、MOL 005573-莞花素、MOL 005970-桉树醇、MOL 000210-厚朴酚、MOL 005955-和厚朴酚的度值分别为36、7、3、4、3、3。说明槲皮素、葛花苷元、桉树醇等在治疗COVID-19方面具有较大潜在活力，尤其是槲皮素(见图2)。

2.4 厚朴-广藿香治疗COVID-19潜在作用靶点的PPI网络

构建出的PPI网络(图3)包含47个节点，571条边，平均节点度值为24.3。网络图中圆代表蛋白，线代表蛋白与蛋白相互作用关系。图中圆圈大小由内至外依次变小，颜色由深变浅，表示该网络中蛋白蛋白相互作用关系越不相关，颜色越深，圆圈越大代表该节点的度值(degree)越大，在网络中的作用越重要。经过拓拔分析，其中节点度值最大为40(IL6、TNF)，最小为1(F10)。按度值大小依次为IL6、TNF、TP53、CASP3、MAPK1、IL10、CCL2、CXCL8、IL1B等。在网络蛋白互作图中，度值越大表示该节点蛋白在网络中起关键作用，选取度值前9的节点分析，这些度值较高的靶点(degree≥35)可能是厚朴-广藿香发挥治疗作用的关键靶点。

2.5 GO生物富集分析及KEGG通路富集分析

通过Metascape数据库将1.3中的交集靶点进行GO和KEGG富集分析，共有4 854条生物功能显著富集(P<0.01)，其中BP条目4 178个，CC条目311个，MF条目365个。在BP中靶点主要涉及细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应、凋亡信号通路、白细胞分化、细胞增殖的负调控等；在CC中靶点主要涉及膜筏、转录因子复合体、核包膜；在MF中靶点主要涉及细胞因子受体结合、转录因子结合、磷酸酶结合、蛋白激酶活性等。分别选取满足1.5中设定条件的lgP(图中为Log10)值，将得到的富集分析结果用分别采用高级气泡图进行可视化分析。详见图4、图5、图6。

使用Metascape数据库对47个潜在作用靶点进行KEGG通路富集分析。结果共得到187条信号通路(P<0.01)，前20个条目及其他大部分条目主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、MAPK信号通路、细胞凋亡等通路。选取lgP值较小的前20条通路,利用高级气泡图进行可视化分析。详见图7。

图2 “药物-活性成分-疾病靶点”网络图

图3 潜在靶点的相互作用(PPI)网络图

3 讨论

脾胃居于中焦，为气机升降、水液代谢、水谷传化之枢[10]。有学者将此次疫病归于“寒湿疫”[11]，认为寒湿直入脾胃而致水谷不得运化，寒湿疫毒闭肺困脾为核心病机，治疗应宣肺透邪、健脾除湿、辟秽化浊，从表、肺、脾胃三个途径开通肺气。而临床COVID-19的常见症状有腹泻、恶心、呕吐等表现[12]，这充分揭示了中焦脾胃病变在新冠肺炎中的重要影响。厚朴-广藿香配伍重在治疗湿滞中焦证，寒邪易伤脾阳致脾虚生湿[13]，故厚朴-广藿香临床治疗“寒湿疫”的中医机理是通过两药配伍散寒除湿、和胃止呕从而达到寒湿除，疫病去的效果。从早期临床表现来看，药物配伍使用率最高者为“厚朴-广藿香”，体现于藿香正气胶囊、藿朴夏苓汤、荆防藿朴解毒方等众多初期中成药或治疗方中[14]。基于此，对厚朴-广藿香中有效潜在活性成分及其对应疾病靶点之间的关系研究在厚朴-广藿香配伍治疗COVID-19方面具有较大前景。

本研究运用网络药理学研究方法共筛选出厚朴-广藿香活性成分15个，作用靶点227个，借助数据库进一步得到具有潜在治疗COVID-19活性成分6个，潜在作用靶点47个。从“药物-活性成分-疾病靶点”网络拓拔分析来看，得到可能治疗COVID-19关键化合物为槲皮素、葛花苷元、莞花素、桉树醇、厚朴酚、和厚朴酚。现代药理研究证实，槲皮素有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降糖及免疫调节等作用[15]。有国外研究者认为槲皮素是一种最有希望应用于疾病预防和治疗的天然化合物[16]。此外还发现槲皮素纳米粒能降低IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌水平，在蛋白水平下调NLRP3、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的表达从而起到抗炎作用，另外还可通过组织NF-κB的活性在mRNA水平和蛋白水平抑制诱导型一氧化氮合酶(iN-OS)、环氧化酶2(COX-2) 和C反应蛋白(CRP)途径从而起到抗炎作用[17]。再者槲皮素还可有效抑制肺纤维化相关蛋白FN,α-SMA,Collagen I的表达水平并且抑制S1P、SphK1表达，从而改善肺纤维化，减轻肺纤维损伤[18]。葛花苷元和和莞花素均是黄酮类化合物，有国外学者研究指出大多数黄酮类活性化合物可以通过阻断病毒和宿主受体结合、抑制病毒复制、直接靶向杀灭病毒、抑制机体炎症反应、调节宿主免疫反应等多途径协同发挥发挥广谱抗病毒作用[19]，此外黄酮类物质还可以抑制EB病毒在细胞内的表达[20]，能通过直接杀灭病毒、抑制病毒唾液酶活性、阻断病毒吸附等途径抗流感[21]，由此可见葛花苷元和莞花素具有潜在的抗病毒，抗流感活性。同时，已有研究表明，槲皮素，葛花苷元能够与SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2 进行较为稳定的构象对接，其结果与现阶段文献报道新型冠状病毒肺炎常用药物如瑞德西韦、洛匹那韦、利巴韦林等相近[22-23]。另外基于已有文献报道，厚朴中厚朴酚、和厚朴酚、厚朴木脂等体Ⅰ、桉叶油醇、和厚朴新酚、新橙皮苷、反亚油酸甲酯具有抗菌、抗病毒、抗炎、潜在抑制花生四烯酸代谢通路，改善肠动力促进肠运动等作用[24-26]。广藿香中广藿香醇具有明显的抗柯萨奇病毒、抗腺病毒和抗甲型流感病毒的作用[27]，同时相关文献指出广藿香中广藿香油具有显著抗菌、抗流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒、调节肠胃功能、止咳、平喘、止呕、抗炎、镇痛、调节免疫等作用[28-30]。故厚朴-广藿香治疗COVID-19具有较高的开发前景。

通过PPI网络分析筛选可知厚朴-广藿香主要通过IL6、TNF、TP53、CASP3、MAPK1、IL10、CCL2、CXCL8、IL1B这9个靶点发挥主要治疗作用。IL6、IL10、CCL2、IL1B介导炎症反应，共同参与炎症的多条通路。HUANG C等[31]在《柳叶刀》发文指出新型冠状病毒的感染与“细胞因子风暴”存在密切联系，“细胞因子风暴”是机体对病毒、细菌等外界刺激产生的一种过度免疫反应[26]。而在9个关键靶点中有6个与“细胞因子风暴”有关，其中IL家族是最重要的炎症因子,TNF是一种可激活炎性应答、诱导细胞凋亡、参与免疫调节的细胞因子，CCL2为CC趋化因子亚家族成员之一，可对炎症细胞产生募集作用、还能够能够刺激平滑肌收缩[32]。MAPK1是丝分裂原活化蛋白激酶家族成员，在细胞的增殖、分化、转化及凋亡过程起着重要作用。CASP3在调控细胞的增殖和凋亡方面发挥关键作用。有学者研究发现CASP3能够明显抑制先天免疫激活，进而防止细胞因子过度产生[32]。TP53是最重要的抑癌基因之一，其编码的蛋白——肿瘤抑制蛋白p53能够使许多基因保持其稳定性，并调节细胞的生长、分化、衰老[34]。

通过GO生物富集分析主要涉及细胞因子介导的信号通路、脂多糖反应、细胞凋亡、细胞增殖的负调控等过程。对于脂多糖反应，近年来研究表明，LPS可以触发TLR通路，进而诱导NF-κB等激活和炎性细胞因子的产生[35]。此外，LPS还可通过激活NLRP3炎症小体从而诱导典型的细胞凋亡[36]。大量文献表明细胞因子介导的通路与炎症密切相关[37-38]。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，其主要途径为死亡受体途径和线粒体途径[39],执行依据主要为caspase-3的活化及其对多种蛋白酶和核酸酶的水解活化[40]。

KEGG富集结果分析得到主要涉及的通路有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、细胞凋亡等通路。AGE-RAGE信号通路能激活NF-κB信号通路，刺激产生VGEF从而增加血管通透性，同时还能增强TGF-β1、MCP-1的表达。这些作用有助于促炎细胞的表达与释放,进而引起慢性细胞活化和组织损伤及促进纤维化[41]。IL-17信号通路与炎症密切相关，IL-17作用于内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞后产生IL-6,引起炎症发生[42]，另外当IL-17作用于树突状细胞或巨噬细胞时引起IL-1、TNF和IL-6的分泌,导致炎症[43]。IL-17信号通路参与免疫反应,T细胞亚群平衡会导致炎症反应加剧,可能造成肺损伤[44]。MAPK信号通路和NF-κB信号通路也是炎症反应中的重要通路，研究报道通过调节NF-κB信号通路可以起到控制炎症反应且改善炎性纤维化[45-46]。由此可以预测厚朴-广藿香可能调节多条信号通路，主要是通过减少炎症反应、减少纤维化、抑制细胞损伤凋亡来达到治疗COVID-19的目的。

综上所述，通过网络药理学技术初步探讨了厚朴-广藿香通过多成分、多靶点、多通路从炎症反应、减少纤维化、细胞凋亡等方面治疗 COVID-19的作用机制。鉴于网络药理学的局限性[47]，后期须进一步对主要活性成分、关键潜在靶点和关键通路进行验证，并且围绕相关潜在靶点，代谢通路进行动物体内外药理实验，对厚朴-广藿香治疗COVID-19的作用机制进行深入探讨，为进一步研究和新药开发提供参考。