miR-15b-5p对大鼠的胰腺外分泌细胞 AR42J凋亡的影响

王福贵　王小蝶　余维丽　孙昀

摘要 目的 研究小的非编码RNA（miRNAs）miR-15b-5p对在雨蛙素处理下的大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞凋亡的影响。方法  在体外利用雨蛙素诱导AR42J细胞创建胰腺炎模型 ，并利用qRT-PCR和Western blot测定使用miR-15b-5p inhibitor和mimics后细胞内Caspase-3及Caspase-9的mRNA和蛋白质相对表达水平;采用流式细胞术来测定各组细胞的凋亡状况。结果  在使用miR-15b-5p inhibitor后，细胞凋亡有关基因组中Caspase-3及Caspase-9的mRNA相对表达水平和蛋白质相对表达量减少，而细胞凋亡率相对降低（P<0.05）;而使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-3及Caspase-9的mRNA相对表达水平和蛋白质相对表达量上升，细胞的凋亡率升高（P<0.05）。结论  miR-15b-5p inhibitor能够减少由雨蛙素所诱发的胰腺外分泌细胞凋亡，表明它可能是防治急性胰腺炎有效的潜在靶点。

关键词：miR-15b-5p;AR42J细胞;急性胰腺炎;细胞凋亡。

中图分类号 R 34

急性胰腺炎（Acute pancreatitis， AP）是一种典型的胃肠疾病，以胰腺外分泌细胞中胰蛋白酶原的特异活化以及随后胰脏的自我消化过程为特征，引起胰脏腺泡损伤、强烈的全身性炎症反应和多器官衰竭。胰脏炎症及腺泡细胞的坏死和凋亡是AP主要的病变特征。虽然AP检查和处理技术目前已经有所提高，但大约20%的胰腺炎病人仍可发展为中度至重症急性胰腺炎（Severe acute pancreatitis，SAP），SAP发病迅速，其病人死亡比例可高达30%。所以对AP发病机制有更准确的认识，对开发更好的治疗措施至关重要。

MicroRNA（miRNA）是一类内源性、高度保守、单链非编码RNA，可以通过识别并于靶基因的非转录3'-非转录区域（3' UTR）互补和配对，进而导致靶基因分解或翻译过程的调控。大量的科学研究也已证明，miRNA在细胞发育、分化、增殖、凋亡等多种生物活动中发挥着调节作用。miR-15b-5p是一个成熟的miRNA，剪切于pro-mir-15b的5'端，位于3号染色体长臂。已知mir-15b-5p在帕金森、直肠癌等中上调，而在甲状腺瘤和糖尿病肾病中低表达。然而，mir-15b-5p在AP中的生物学功能及其机制尚不清楚。

研究拟探讨miR-15b-5p在大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞凋亡中的作用机制，以期为研究AP发病机制和临床诊断提供新的理论研究和思路。

1材料与方法

1.1主要试剂与材料

大鼠腺胰腺外分泌细胞AR42J购于上海富衡细胞库。miR-15b-5p的inhibitor和mimics及阴性对照均购于新贝（上海）生物科技有限公司。Lipofectamine 2000购于美国Life Technology公司。Opti-MEM（x1）培养基购买于美国Gibco公司。雨蛙素干粉购买于北京索莱宝科技有限公司;qRT-PCR试剂盒购买于日本Takara公司。Caspase-3、Caspase-9及 β-Actin抗体均购于武汉三鹰生物技术有限公司。Annexin-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购于上海七海复泰生物科技有限公司。

1.2 细胞复苏、培养与转染

预热含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，从液氮罐中拿出冻存有AR42J细胞的冻存管，于水浴锅内完全溶解，在无菌操作台内，用1ml含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，将细胞种于培养瓶内，放置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。每2-3天进行一次细胞传代。待其生长至对数生长期时，将用胰酶消化液（0.25%胰酶）消化重悬好的细胞直接接种于六孔板中，使细胞生长至60%-80%汇合度后，于避光条件下使用Lipofectamine 2000试剂进行细胞转染24小时。分别记为：A： 空白对照组（不做任何处理的AR42J细胞）、B： miR-15b-5p mimics NC组 、 C： miR-15b-5p mimics组、D： miR-15b-5p inhibitor组、F： miR-15b-5p inhibitor NC组。

1.3 qRT-PCR测定各组细胞中miR-15b-5p miRNA相对表达水平

取出转染好的所有组细胞，用TRIzol试剂提取出细胞中的全部RNA。用紫外线分光光度计检测miRNA浓度和纯度，合格后进行逆转录，转录反应条件：25℃、5min，50℃、15min，85℃、5s。合成cDNA以预备使用。按照表1中所示引物序列，采用荧光定量PCR扩增仪，根据以下要求完成荧光定量PCR反应，即95℃、30s预变性;95℃、5s，60℃、20s，共四十个循環;95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，在反应结束后，以 U6基因为内参照，计算miR-15b-5p相对表达含量，见图1。

1.4雨蛙素造模

转染成功后，用雨蛙素（100 nmol/L）刺激24 h，诱导好的细胞可以进行后续实验。实验分为6组，分别记为：空白对照组（不做任何处理的AR42J细胞）、雨蛙素组、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组 、 雨蛙素+miR-15b-5p mimics组、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor组。再次测定各组细胞中miR-15b-5p miRNA相对表达水平，计算miR-15b-5p相对表达含量，见图2。

1.5 qRT-PCR测定各组细胞中细胞凋亡相关基因Caspase-3和Caspase-9 相对mRNA相对表达水平

取出转染并造模后的各组细胞，使用TRIzol試剂提取出细胞中的全部RNA。用紫外线分光光度计检测RNA浓度和纯度，合格后进行逆转录，合成cDNA以预备使用。按照表2中所示引物序列，采用荧光定量PCR扩增仪根据以下要求完成荧光定量PCR反应，即95℃、30s预变性;95℃、5s，60℃、20s，共四十个循环;95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，在反应结束后，以β-actin基因为内参照，计算Caspase-3及Caspase-9的mRNA相对表达含量。见图3。

1.6Western blot法测定细胞中细胞凋亡关键蛋白Caspase-3和Caspase-9的相对表达水平

取出之前处理好的各组细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞，同时予以蛋白酶抑制剂抑制蛋白降解，获得总蛋白质后，用BCA检测试剂盒完成蛋白定量分析。之后进行凝胶电泳及对应蛋白分子的转膜。转膜后，在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，慢摇并于室内温度下封闭PVDF膜约2 h，再用TBST溶液洗涤浸泡3x10 min。在相对应的一抗抗体中4℃孵育过夜。第二天再用TBST冲洗3x10 min，然后在相对应的二抗中孵育条带1 h左右，最后再用TBST冲洗3x10 min。然后用ECL化学发光底物显影检测对应的蛋白质，最后用Image-J处理图像，以β-Actin为内参计算其蛋白质相对表达量。

1.7流式细胞仪测定各组细胞的凋亡状况

取已处理好的所有组细胞，加入胰酶（不含EDTA）适度消化，吹离细胞后，予以500 g离心力离心5 min，将细胞收集，并吸去上清，加入1 ml PBS溶液再次洗涤细胞，然后将加入PBS溶液的细胞于500 g离心力下离心5 min，再次吸去上清，再加入400 μl Binding Buffer吹匀细胞，每组加入5 μl 的Annexin V-FITC试剂，在室温下静置约15 min，再加入10 μl的PI试剂，避光冰浴静置5 min。在30 min内，使用CytoFLEX流式细胞仪进行凋亡状况测定，并用CytEepert软件进行解析。

1.8统计学处理

采用SPSS17.0软件进行分析，数据以±s表示，两组均数采用t检验比较，多组数据之间采用方差分析比较。所有数据至少进行三次独立实验。P值< 0.05被认为具有统计学意义。

2.1转染后miR-15b-5p miRNA相对表达水平

与空白对照组相比较，miR-15b-5p mimics NC组 、miR-15b-5p inhibitor NC组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平无统计学意义;与miR-15b-5p mimics NC组相比，miR-15b-5p mimics组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平增高（F=24.65，P<0.05）;反之，miR-15b-5p inhibitor NC组相比，miR-15b-5p inhibitor组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平降低（F=83.86，P<0.05），见图1。说明转染成功。

2.2使用雨蛙素造模后各组中miR-15b-5p miRNA相对表达水平

与空白对照组相比较，雨蛙素组中的miR-15b-5p miRNA表达水平增高（F=21.32，P<0.05）;雨蛙素组、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平无统计学意义;与雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平增高（F=64.24，P<0.05）;反之，与雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor组中的miR-15b-5p miRNA相对表达水平降低（F=65.73，P<0.05），见图2。说明使用雨蛙素胰腺炎造模后，miR-15b-5p在胰腺炎细胞中高表达。

2.3使用雨蛙素造模后各组中Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平

与空白对照组相比较，雨蛙素组中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达水平增高（F=82.96、41.85，P<0.05）;雨蛙素组、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平无统计学意义;与雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics组中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平增高（F=66.10、18.24，P<0.05）;反之，与雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor组中的Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平降低（F=91.14、6.36，P<0.05），见图3。说明使用miR-15b-5p inhibitor后，细胞凋亡有关基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平下降，而在使用mimics之后，细胞凋亡有关基因Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平提高。

2.4使用雨蛙素造模后各组中Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达水平

与空白对照组相比较，雨蛙素组中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白質相对表达水平增高（F=29.70、31.82，P<0.05）;与雨蛙素组、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白质相对表达无明显统计学意义;与雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组相比，雨蛙素+miR-15b-5p mimics组中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白质相对表达水平增高（F=20.14、76.98，P<0.05）;反之，与雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor组中的Caspase-3和Caspase-9的蛋白质的相对表达水平降低（F=54.01、48.73，P<0.05），见图4。说明使用miR-15b-5p inhibitor后，细胞凋亡有关基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白质相对表达水平下降，而在使用mimics以后，细胞凋亡有关基因Caspase-3和Caspase-9的蛋白质的相对表达水平上升。

2.5使用miR-15b-5p inhibitor和mimics后各组细胞的凋亡发生率

与空白对照组相较，雨蛙素组中的细胞凋亡发生率增高（F=26.41，P<0.05）;雨蛙素组、雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组 、雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组中的细胞凋亡发生率差异并无统计学意义;与雨蛙素+miR-15b-5p mimics NC组相比较，miR-15b-5p mimics + 雨蛙素组中的细胞凋亡发生率升高（F=34.27，P<0.05）;反之，与雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor NC组相比，雨蛙素+miR-15b-5p inhibitor组中的细胞凋亡发生率下降（F=76.92，P<0.05），见图5。说明使用miR-15b-5p inhibitor后，细胞凋亡率发生下降，而在使用mimics以后，细胞凋亡发生率上升。

3讨论

在本研究中，我们证明了miR-15b-5p在雨蛙素诱导的胰腺外分泌细胞中高表达，miR-15b-5p inhibitor可以通过抑制Caspase-3和Caspase-9的表达水平，减轻雨蛙素诱导的胰腺外分泌细胞的凋亡。我们的结果为研究雨蛙素诱导的AP凋亡提供了理论依据。

雨蛙素诱导AP是一种成熟的AR42J细胞造模实验模型。有研究表明，miRNAs可参与调节胰腺外分泌细胞的增殖、活化、凋亡等过程，从而影响AP进展。Shen Yang等证实miR-9 mimics降低AP的炎症反应和凋亡。Zhang Yongpeng等证明miR-551b-5p参与AP炎症反应的调控。结合miR-15b-5p在乳腺癌、糖尿病肾病等疾病中发挥着抑制细胞凋亡的作用，我们推测miR-15b-5p在AP中起着调控凋亡的作用。在我们的研究中，我们发现miR-15b-5p的mimics与胰腺外分泌细胞的功能障碍之间具有相关性。雨蛙素处理后的大鼠胰腺外分泌细胞中miR-15b-5p表达上调，结果和早期大鼠动物实验一致。

另外，越来越多的证据表明胰腺外分泌细胞的死亡可能是AP发病的主要机制。而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）则作为一种主要的凋亡蛋白酶，处于细胞凋亡通路的下游，Caspase-3在细胞胞质中以无活性的酶原形态呈现，在细胞产生凋亡信号时，发生裂解并被激活，使细胞走向死亡。在我们的实验中，通过细胞转染，成功得到miR-15b-5p inhibitor和miR-15b-5p激活的AR42J细胞株，使用miR-15b-5p inhibitor后，Caspase-3表达水平下降，AR42J细胞凋亡水平下降，使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-3表达水平上升，AR42J细胞凋亡水平上升。miR-15b-5p对Caspase-3表达水平的影响和早期的报道一致。这些结果表明miR-15b-5p可能参与并调控胰腺外分泌细胞的凋亡。

Caspase-3主要通过三个途径参与细胞凋亡过程，一是线粒体介导的细胞凋亡途径，二是死亡受体介导途径，三是细胞毒性T淋巴细胞所介导的颗粒酶B途径。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（ Caspase-9） 位于凋亡级联反应上游，并活化下游效应Caspase。在本研究中，我们观察到，使用miR-15b-5p inhibitor后，Caspase-9的表达水平下降，使用miR-15b-5p mimics后，Caspase-9的表达水平上升。说明miR-15b-5p可能通过活化Caspase-9激活下游Caspase-3，经由线粒体途径诱发细胞凋亡。

本研究初步论述了miR-15b-5p在调节胰腺外分泌细胞凋亡方面的分子机制，未来还可继续研究miR-15b-5p上游及下游靶基因，从而进一步探讨miR-15b-5p参与胰腺细胞凋亡的具体机制，以期为AP的疾病诊断和预防提出新的依据。

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作者简介：王福贵，男，硕士研究生， E-mail：wfg1994@126.com 电话：18326661901

孙昀：男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：sunyun15@163.com

基金项目：安徽省高校自然科学重点项目基金（编号：KJ2017A183）;安徽医科大学第二附属医院临床研究培育计划项目（编号：2020LCZD08）