过表达和沉默NbRbcS基因对烟草主要病毒侵染的影响

罗健达 刘笑玮 宋丽云 李莹 申莉莉 卢燕回 李永亮 李斌 王凤龙 杨金广

摘  要：为明确Rubisco酶小亚基（Rubisco small subunit，RbcS）在烟草抵抗主要病毒侵染胁迫中的作用，以本氏烟为研究材料，利用qRT-PCR、Western blot和瞬时表达体系对烟草RbcS基因在TMV、CMV和PVY侵染中的调控作用进行系统分析。结果表明，3种病毒侵染本氏烟均引起NbRbcS在mRNA水平和蛋白水平上下调，瞬时过表达NbRbcS，病毒拷贝数均显著降低。而沉默NbRbcS，TMV、CMV和PVY拷贝数分别达到阴性对照的11.12、9.57和17.76倍。对PVY引起的斑驳叶片中深绿色和浅绿色区域分别进行qRT-PCR分析发现，在浅叶区NbRbcS mRNA的表达量只有深叶区的49.10%，但PVY的拷贝数却达到了深叶区的5.18倍。以上研究表明，RbcS大量表达可增强烟草对病毒的防御能力，烟草RbcS基因可作为潜在的抗病毒基因利用。

关键词：烟草;RbcS基因;胁迫响应;TMV;CMV;PVY

Abstract： In order to clarify the role of Rubisco small subunit （RbcS） in tobaccos resistance to major virus infection， using Nicotiana benthamiana as the main research material， the regulatory role of the RbcS gene in TMV， CMV and PVY infection was systematically analyzed. The results showed that the infecting of the three viruses all caused down-regulation of NbRbcS expression at the mRNA and protein levels. Transient over-expression of NbRbcS significantly reduced the copy number of TMV， CMV and PVY. When the NbRbcS gene was silenced， the copy number of the three viruses all increased significantly， reaching 11.12 times， 9.57 times， and 17.76 times of the negative controls. The dark and light green area of mottled leaves caused by PVY were analyzed by qRT-PCR. The results showed that in the light green leaf areas， the expression of NbRbcS mRNA was only 49.10% of the dark green leaf areas， but the copy number of PVY was 5.18 times of that in the dark green leaf areas. The above results indicated that over-expression of RbcS can enhance the defense ability of tobacco against viruses. The tobacco RbcS gene can be used as a potential anti-virus gene.

Keywords： tobacco; RbcS gene; stress response; TMV; CMV; PVY

烟草病毒病是危害烟草的主要病害之一，每年给烟叶产区造成巨大的损失[1-2]。我国发现20余种病毒可侵染烟草[3-4]，其中烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染我国烟草的主要病毒种类[5-6]。病毒侵染植物后引起的叶片褪绿、斑驳、畸形、坏死等是最典型和常见的症状[7-8]，这反映出病毒破坏了叶绿体的结构和光合色素，调控了叶绿体蛋白的表达[9]。葉绿体是植物光合作用的场所，也是众多植物病毒侵染时共同攻击的目标，在病毒侵染植物时扮演着重要而复杂的角色[10]。核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）定位于叶绿体中，是植物叶片中含量最丰富的可溶性蛋白[11]。Rubisco是一种双功能酶，既是光合作用中卡尔文循环的关键酶，也是光呼吸反应中的第一个酶，通过双向催化可以调控光合作用和光呼吸的效率，从而决定净光合效率[12]。Rubisco酶由8个大亚基RbcL（Rubisco larges subunit）和8个小亚基RbcS（Rubisco small subunit）组成[13]。RbcL上含有丰富的Rubisco酶催化位点和活化位点，但RbcL的表达量及Rubisco酶的组装和活性依赖于RbcS的调控[14]。在高等植物中，RbcL由叶绿体基因组编码，而RbcS由核基因编码[15]。由于RbcL上活性位点较多，众多学者的研究焦点都聚集在RbcL上，忽视了RbcS在Rubisco酶结构和功能中的作用[16]。前人研究表明RbcS蛋白参与植物抗逆信号的传导过程，在植物生长各环节均发挥着重要作用[17]。贺超英等[18]研究表明，RbcS基因对外界不同处理（如水杨酸、氯化钠、低温和干旱等）具有明显的应答效应。本研究主要探讨NbRbcS基因对RNA病毒侵染烟草的应答变化，并且分析其过表达和沉默表达对病毒侵染胁迫的影响，以期进一步揭示植物RNA病毒的致病机理。

1  材料与方法

1.1  试验时间、材料

试验于2019年3月至2020年5月在中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心进行。PVYN、TMV-U1、CMV-Fny病毒株系，侵染性克隆PVY-GFP、TMV-GFP由本实验室提供。本氏烟（Nicotiana benthamiana）生长条件：温度25 ℃，湿度60%，光暗周期16 h/8 h，光照强度2000 lux，灭菌基质营养土培养。

1.2  植物表达载体构建

基于酶切位点AhdI设计引物pGWC-RbcS-F/R（表1），扩增NbRbcS CDS（登录号：LN877373.1），一步克隆法连接至pGWC载体。利用LR重组酶（Invitrogen）反应得到过表达载体pEarleyGate100-RbcS。基于pTRV2的酶切位点EcoRI、KpnI，设计引物pTRV2-RbcS-F/R，扩增NbRbcS CDS，一步克隆法得到沉默载体pTRV2-RbcS。重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞Trans1T-1（TransGen Biotech）。挑取单克隆，测序，阳性克隆转至农杆菌感受态细胞LBA4404（TransGen Biotech）。本试验引物合成及测序均由派森诺生物科技有限公司完成。

1.3  试验设计

1.3.1  TMV、CMV、PVY侵染本氏烟对NbRbcS表达的影响  以摩擦PBS（磷酸盐缓冲溶液）为阴性对照，用摩擦接毒法，分别接种TMV、CMV、PVY于6周龄本氏烟第7叶。由于3种病毒发病规律不一样，分别于病毒侵染后第6、7、8天取系统叶（第11叶及以上叶片，后同），取3个重复，液氮速冻，?80 ℃保存。

1.3.2  过表达NbRbcS对TMV、CMV、PVY侵染本氏烟的影响  将含pEarleyGate100-RbcS与pEarleyGate100农杆菌活化培养，重悬菌液至OD600值为1.0，暗中静置3 h。以浸润pEarleyGate100农杆菌为阴性对照，用pEarleyGate100-RbcS农杆菌浸润6周龄本氏烟第7、11叶。12 h后，分别在第7片浸润叶上接种TMV、CMV、PVY。分别于浸润后第3、4、5天取第11叶，取3个重复，液氮速冻，?80 ℃保存。

1.3.3  沉默NbRbcS对TMV、CMV、PVY侵染本氏烟的影响  将菌液pTRV1与pTRV2-RbcS 1：1混合浸润4周龄本氏烟第6叶，以pTRV1与pTRV2 1：1混合处理为阴性对照。于14 d取系统叶，检测沉默效率后，将TMV、CMV、PVY分别接种于第9叶。分别于接种后3、4、5天取系统叶，取3个重复，液氮速冻，?80 ℃保存。

用TMV-GFP与PVY-GFP侵染沉默NbRbcS的本氏烟及阴性对照，分别于侵染3 d和6 d后在手持长波紫外灯下观察病毒荧光表达情况。

1.3.4  PVY引起的斑驳花叶中NbRbcS与PVY的表达情况分析  取PVY侵染30 d有明显斑驳的叶片，利用解剖刀将斑驳叶根据绿色深浅分离，分别置于液氮中速冻保存。

1.4  相对荧光定量PCR（qRT-PCR）分析

利用TRIzol法提取本氏烟总RNA，HiScriptII Q Select RT SuperMix for qPCR（Vazyme）反转录，合成cDNA。以各样品cDNA为模板，NbActin为内参基因，根据试剂盒AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme）说明配制反应体系，置于Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System中完成qRT-PCR反应。反应程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40循环;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。利用2-△△CT法计算相对表达量，独立样本T检验法进行数据差异性检验分析。NbRbcS，NbActin与3种病毒定量检测引物详见表1。

1.5  蛋白质印迹法（Western Blot， WB）分析NbRbcS表达量差异

将试验1.3.1所取樣品在液氮中充分研磨，1 g研磨组织加1 mL蛋白裂解液（北京康为世纪生物科技有限公司生产），冰上裂解30 min，4 ℃离心20 min，取上清弃沉淀，得植物总蛋白。经SDS-PAGE电泳及200 mA湿法转膜90 min，将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜（Bio-Rad）置于含5% BSA的TBST封闭2 h。PVDF膜用RbcS抗体（Agrisera，兔源）与Actin抗体（Phytoab，鼠源）4 ℃过夜孵育，对应二抗室温孵育1 h。将发光底物工作液加在PVDF膜上，置于化学发光成像系统（Tanon 5200）内检测目的蛋白条带。

2  结  果

2.1  病毒侵染对烟草NbRbcS基因表达的影响

本氏烟接种TMV、CMV、PVY后，系统叶初期产生褪绿畸形症状（图1）。将试验1.3.1所取样品进行qRT-PCR分析，结果显示（图2），TMV、CMV、PVY侵染本氏烟均能引起NbRbcS mRNA表达下调，分别下调59.55%，36.71%，64.24%，差异显著（p<0.05）。蛋白水平的检测结果与RNA水平一致（图3），TMV、CMV、PVY处理后，系统叶中NbRbcS蛋白的表达量均低于对照组，该结果表明病毒侵染烟草可抑制NbRbcS表达。

2.2  瞬时过表达NbRbcS对烟草主要病毒侵染复制的影响

为验证NbRbcS对主要病毒侵染复制的影响，对试验1.3.2所取样品中TMV、CMV和PVY进行qRT-PCR分析。由图4可见，瞬时过表达NbRbcS能够抑制病毒侵染复制，使TMV、CMV、PVY的拷贝数分别下调33.25%、33.13%、51.66%，差异显著（p<0.05），该结果表明本氏烟NbRbcS蛋白具有潜在的抗病毒特性。

2.3  沉默NbRbcS对烟草主要病毒侵染复制的影响

利用VIGS（病毒介导的沉默系统）沉默NbRbcS，沉默效率达到72.11%（图5），沉默NbRbcS本氏烟的系统叶明显地黄化褪绿，类似病毒侵染初期的明脉褪绿症状（图6）。接种TMV、CMV、PVY后，对系统叶病毒拷贝数进行qRT-PCR分析，TMV、CMV、PVY相对拷贝数分别是对照组的11.12倍，9.57倍，17.76倍，差异极显著（p<0.01）（图7）。

接种PVY-GFP 6 d，沉默NbRbcS的本氏烟系统叶病毒荧光面积显著大于阴性对照（图8）。接种TMV-GFP 3 d，沉默NbRbcS的本氏烟的接种叶上平均有61.33个病毒荧光斑点，而对照组平均只有25.67个，处理组是对照组的2.38倍，差异显著（p<0.05）。结果表明NbRbcS能抑制烟草病毒侵染复制。

2.4  PVY侵染本氏烟形成的斑驳花叶中NbRbcS与PVY的表达分析

为探究病毒侵染后斑驳花叶症状与寄主NbRbcS表达的关系，本研究以PVY侵染本氏烟30 d的叶片为研究材料，此时叶片出现严重斑驳、畸形等症状（图9），对斑驳叶深色区和浅色区的PVY 和NbRbcS表达量进行qRT-PCR分析。结果表明，在浅叶区NbRbcS表达量只有深叶区的49.10%（图10），但PVY的拷贝数却达到深叶区的5.18倍，上述结果表明病毒侵染后产生的斑驳花叶症状与NbRbcS表达密切相关。

3  讨  论

植物受到生物胁迫和非生物胁迫时，体内会发生一系列生理生化变化，进而增强其耐受力或抵御力[19-20]。干旱胁迫下叶片中光合作用相关蛋白表达量发生變化，以抵御干旱胁迫[21]。干旱胁迫使植物Rubisco酶活性降低，RbcL和RbcS表达量降低，而在耐旱材料中RbcL和RbcS表达量较高[22]。HU等[23]发现调整营养液NH4+∶NO3?比例，可提高白菜RbcL、RbcS等基因的表达量，白菜在弱光条件下的光合作用增强，碳水化合物的积累增加，耐弱光能力提升。本试验过表达NbRbcS基因可降低TMV、PVY和CMV的拷贝数，进一步说明RbcL和RbcS基因能提高植物抗逆能力。

干旱胁迫、盐胁迫等会影响Rubisco酶活性及表达 [24-25]，学者对Rubis-co酶响应非生物胁迫的研究较深入，而在生物胁迫中研究较少[26-27]。ZHAO等[28]发现NbRbcS能够与番茄花叶病毒（ToMV）多功能运动蛋白互作;沉默本氏烟NbRbcS能增强ToMV在接种叶的感染;在抗ToMV转基因本氏烟中沉默NbRbcS，则降低了其抗性。沉默NbRbcS，ToMV能有效地局部感染，但不能系统地移动。本研究发现沉默NbRbcS同样显著降低了本氏烟对TMV、PVY和CMV的御防能力，但不影响病毒的系统移动。推测RbcS通过与病毒蛋白互作，影响病毒蛋白功能，从而提高植物对病毒的防御能力。前人研究表明，病毒能降低Rubisco酶活性[29]，改变宿主叶绿体的结构，影响其功能，甚至可以利用叶绿体进行复制增殖，表明叶绿体与病毒的生命周期密切相关[30]。RbcS是叶绿体的主要可溶性蛋白之一，可调节Rubisco酶活性，对于叶绿体发挥功能有重要作用。推测RbcS的大量表达利于Rubisco酶发挥功能，维持光合作用的稳定，为防御代谢提 供物质保障，限制病毒活动。

虽然RbcS过表达可以增强植物对病毒的抵御能力，但病毒同样进化出反抑制机制，TMV、PVY和CMV侵染均导致NbRbcS表达下调，进而利于病毒的大量复制和花叶的形成。但斑驳花叶的形成是由于寄主为限制病毒的猖獗扩繁，提高局部NbRbcS的表达来抵御病毒，以维持较高光合效率 导致;还是病毒为持续获得较好营养条件，与寄主更好地共生而局部减弱对RbcS的降解调控所致，有待深入研究。RbcS在防御病毒过程中怎样起作用，病毒通过何种途径调控RbcS的表达，也需要深入研究阐明。

4  结  论

本研究结果表明，本氏烟NbRbcS基因在抵御烟草主要病毒侵染中发挥重要作用。过表达NbRbcS蛋白，能抑制TMV、PVY和CMV 3种病毒的复制增殖。而沉默NbRbcS，则极显著地增强3种病毒对本氏烟的侵染能力。TMV、PVY和CMV侵染均可降低本氏烟NbRbcS在基因和蛋白水平的表达量。PVY引起的斑驳叶片中，浅叶区病毒聚集且RbcS基因表达受到抑制，表明病毒引起的叶片斑驳可能与调控RbcS表达有关。研究结果有助于进一步理解植物病毒的致病机理和植物抗病毒机制，并为病毒病的防控提供新思路。

参考文献

[1]钱玉梅，王凤龙，王劲波，等. 山东省烟草病毒病种群发生动态及防治对策[J]. 烟草科技，2001（2）：43-46.

QIAN Y M， WANG F L， WANG J B， et al. Dynamics of tobacco virus disease population in Shandong Province and countermeasures[J]. Tobacco Science and Technology， 2001（2）： 43-46.

[2]马国胜，何博如. 烟草病毒病的发生与防治研究进展[J]. 河南农业科学，2005（2）：42-46.

MA G S， HE B L. The occurrence and control of tobacco virus disease[J]. Henan Agricultural Science， 2005（2）： 42-46.

[3]马国胜，何博如. 烟草病毒研究现状与展望[J]. 中国生态农业学报，2006（2）：150-153.

MA G S， HE B L. Status and Prospect of tobacco virus research[J]. Chinese Journal of Ecological Agriculture， 2006（2）： 150-153.

[4]彭曙光. 我国烟草病毒病的发生及综合防治研究进展[J]. 江西农业学报，2011，23（1）：115-117.

PENG S G. Progress in research on the Occurrence and Comprehensive control of Tobacco Viral Diseases in China[J]. Journal of Jiangxi Agricultural Sciences， 2011， 23（1）： 115-117.

[5]董鹏，朱三荣，蔡海林，等. 湖南烟草病毒病种类检测与系统进化分析[J]. 中国烟草科学，2020，41（3）：58-64.

DONG P， ZHU S R， CAI H L， et al. Species detection and phylogenetic analysis of tobacco virus diseases in Hunan province[J]. Chinese Journal of Tobacco Science， 2020， 41（3）： 58-64.

[6]田佳，安德榮，雷超，等. 陕西烟田病害种类调查[J]. 中国烟草科学，2016，37（5）：57-62.

TIAN J， AN D R， LEI C， et al. Investigation on diseases in tobacco fields in shaxi province [J]. China Tobacco Science， 2016， 37（5）： 57-62.

[7]睢韡. 湖北省烟草病毒病毒原种类的鉴定[D]. 武汉：华中农业大学，2012.

SUI W. Identification of the original species of tobacco virus in Hubei Province[D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University， 2012.

[8]时洪伟，刘陈晨，李科，等. 重庆丰都烟区田间烟草病毒病及其Dot-ELISA检测[J]. 中国烟草科学，2016，37（2）：6-10.