基于miRNA针灸调控肿瘤免疫抑制微环境的应用潜力探讨

王睿 胡海燕

[摘要] 肿瘤免疫技术昂贵的治疗费用是其在基层单位推广的首要障碍。如何发挥针灸“简便效廉”的优势，将其作为肿瘤免疫抑制微环境正向调控的补充替代方案，合理介入中晚期恶性肿瘤患者“带瘤生存”的过程中，维持机体相对“阴平阳秘”状态，有重要的临床实践意义。miRNA深度参与了肝癌等恶性肿瘤的发生发展过程，又因其具有多层次、多靶点性的特征，较为适合阐释针灸效应机制，可尝试作为研究针灸改善肿瘤免疫功能的利器。目前已有一定数量的文献表明，针灸具有改善肿瘤免疫功能及微环境的能力;探索针灸与miRNA间相互作用原理的文献亦层出不穷。故本文尝试对以上内容进行概述，以肝癌作为研究载体，在课题组前期研究的基础上，分析针灸维持患者“带瘤生存”状态的应用潜力。

[关键词] 针灸;肿瘤免疫抑制微环境;microRNA;肝癌;带瘤生存

[Abstract] The expensive cost of treatment for tumor immune technology is the primary obstacle of its promotion in grass-roots institutions. It is of great clinical practical significance in how to give full play to the advantages of "simple procedures yet cost-effective efficacy" in acupuncture and moxibustion， adopting it as a supplementary alternative to the positive regulation of the tumor immunosuppression microenvironment， reasonably intervening in the process of "survival with tumor" in patients with advanced malignant tumors， and maintaining the body's relative state of "dynamic balance of yin and yang". miRNA is deeply involved in the occurrence and development of malignant tumors such as liver cancer. Because of its multi-level and multi-target characteristics， it is more suitable for explaining the mechanism of acupuncture effects， and can be used as an effective approach to study acupuncture and moxibustion to improve tumor immune function. A certain amount of literature reports have shown that acupuncture has the ability to improve tumor immune function and microenvironment; there is also a great number of literature reports exploring the interaction between acupuncture and miRNA. Therefore， this article attempts to summarize the above content， and on the basis of the former studies of the research team， this article analyzes the application potential of acupuncture and moxibustion to maintain patients′ state of "survival with tumor" using liver cancer as the vehicle of study.

[Key words] Acupuncture and moxibustion; Tumor immunosuppression microenvironment; microRNA; Liver cancer; Survival with tumor

肝癌是世界范圍内最常见的恶性肿瘤之一[1]，我国肝癌患者的发病率和死亡率呈逐年上升趋势[2]，但以肝癌为代表的恶性肿瘤疾病在临床治疗上却存在诸多难点尚待攻克[3]。随着肿瘤免疫技术的蓬勃发展[4]，其本应成为中晚期恶性肿瘤患者的福音，但因费用问题，无法惠及多数经济困难的家庭[5]。在此大环境下，如何发挥我国传统医学“效佳价廉”的特色优势，普及“带瘤生存”理念，寻找一种适合基层单位推广应用的肿瘤免疫疗法的补充替代方案，具有重要的临床实践价值。

安全有效和经济简便是针灸近千年来能维持蓬勃发展的生命线，对免疫功能的正向调节能力是实现针灸疗效不可或缺的条件。选择在肝癌发生发展过程中具有重要调控作用的miRNA（微小核糖核酸，microRNA）作为研究武器，以中医正气学说为指导，把握中晚期肝癌患者肿瘤免疫抑制状态形成的关键效应特征，尝试综合分析针灸与肿瘤免疫抑制微环境的互动关系。将可能使针灸的治疗范围不再局限于肿瘤并发症和放化疗副作用的改善方面，而将目标定在提高中晚期肝癌患者的“带瘤生存”能力上。本文试从中西医基础理论分析、国内外研究现状概述等角度，对针灸调控肿瘤免疫抑制状态的应用潜力进行初步探讨。

1 肿瘤免疫治疗费用较高是其临床尚未普及使用的原因之一

恶性肿瘤的患病率和死亡率日益严重，患者的社会经济负担逐年上升，已然成为了我国公共卫生领域的攻关重点[6]。国内新发恶性肿瘤患者429.2万左右，死亡人数近281.4万，最新研究显示，2015年因恶性肿瘤死亡约为7500人次/d[7]。2015年全球约有恶性肿瘤22%新增和27%死亡病例发生在我国[8]。罹患肿瘤造成的已不仅是人们的健康问题，后期恶性肿瘤患者的劳动能力丧失、医疗费用过高，给其家庭也带来了严重的经济风险。2011—2015年间，我国恶性肿瘤患者的住院开支增长达84.1%，至2015年达到1771亿元，占该年度公共卫生总投入的4.3%，且此项费用近年仍在持续增加[9]。恶性肿瘤为整个社会带来的疾病压力并不限于经济层面，同时也耗费了大量宝贵的医疗资源[10]，所以恶性肿瘤的防治一直是医学研究的热点。

手术、放疗及化疗是传统的三大支柱疗法，然而当恶性肿瘤患者处于中晚期时，常会有因病情复杂以至于不具备手术条件的情况出现;放化疗抑制或杀伤肿瘤细胞的同时，也严重影响了正常组织的功能，导致的并发症及相关副作用，又为患者带来了新的症状和疼痛[11-12]。随着肿瘤免疫相关技术的蓬勃发展，给不能耐受手术或放化疗的恶性肿瘤患者带来了希望，在2013年更被《Science》评为年度十大科技突破之首[13]。其中，鉴于肿瘤细胞具有分泌免疫抑制因子或其他免疫抑制物的功能，可产生免疫逃逸，以躲避机体免疫系统的识别杀伤，形成免疫抑制微环境[14]，是免疫治疗能否发挥疗效的主要障碍。因此通过寻找有效的干预手段，重启已被恶性肿瘤细胞所麻痹而失去作用的免疫系统，是目前肿瘤学界一直迫切讨论的议题。

但肿瘤免疫治疗技术的费用较为昂贵，是其在广大基层单位推广应用受到限制的重要原因之一，使得曾经一度火热的肿瘤免疫疗法有所降温。究其原因，首先其高额的医疗费用，就给大部分家庭设置了遥不可及的门槛[10]。因此，兼顾临床疗效与治疗成本，是保证恶性肿瘤患者最终生活质量的前提。患者需要时刻在生命健康所面临的威胁或巨大的财务压力中不断权衡选择，且因恶性肿瘤的复杂性和疗效不确定性，极有可能最终走向人财两空的结局，对于患者乃至整个家庭都毫无生活质量可言。因农村和欠发达地区的医疗资源投入过少，不仅恶性肿瘤发病率明显高于城镇和发达地区的居民，而且在其明确诊断时常已进入恶性肿瘤晚期阶段[8]。这本属于肿瘤免疫治疗的适用人群，却由于患者的经济原因无法被惠及。

所以，经济压力和社会角色等杂糅相交的复合因素是恶性肿瘤防治过程中无法回避的难题，任何治疗都需要在患者家庭经济条件许可的情况下开展，如何做到成本与疗效兼顾，才是实现生存时间与质量并重的关键。

2 我国传统医学在提升患者“带瘤生存”能力方面具有特色优势

中医作为我国传统医学的瑰宝，是肿瘤防治最重要的补充替代手段，在国内具有极为广泛的群众基础。中医学的核心优势和治疗切入点，主要集中于无法耐受常规治疗手段的高龄及中晚期恶性肿瘤患者。伴随着世界卫生组织（World health organization，WHO）强调发展中国家应加大肿瘤姑息治疗的支持力度，并向世界范围内发出恶性肿瘤实质应为一种慢性的可控性疾病的呼吁[15-16]，“带瘤生存”的理念正在被普罗大众所接受。经过有效的抗肿瘤治疗或对症处理后，患者病情尚属稳定，病灶处于相对静止状态时，如何合理的介入中医治疗，维持人体与肿瘤的“长期共存”，有着极强的临床实践意义[17]。

中医古代文献中虽未专设“肿瘤”一词，但阐释恶性肿瘤病因病机及其治疗方法的有关典籍历史悠久。《内经》就有以人体精气神及阴阳五行理论为指导，针对肿瘤病因病机、治疗原则与机体正邪阴阳盛衰间相互关系的描述。《灵枢》首次出现“肉瘤、肠瘤”的命名，并记载了“息而成积”的发病因素，“大积大聚……衰其大半而止”的治疗措施等内容。在《金匮要略》一书中，详细分析了“积”与“聚”的异同点：“积者，脏病也，终不移;聚者，腑病也，发作有时，辗转痛移，为可治……”。“癌”首见于《卫济宝书（涧痕五发篇》，但将该字用于描述“恶性肿瘤”则归因于《仁斋直指方》，书中曰“癌者，上下高深，岩穴之状，顆颗类垂，毒根深藏”。肿瘤的传统命名亦多由发病部位和性状决定[18]，譬如甲状腺癌古称石瘿（引自《千金要方》），食管癌为噎膈（引自《丹溪心法》）等。

中医学认为，肿瘤发病原因虽有很大不同，患者个体也存在差异，病情更极为多变，但其根本在于阴阳失衡，继而脏腑功能失调，气血瘀滞和毒邪凝聚相互交结，日久变疾;瘤块局部表现为实证，但全身脏腑为虚证。“生之本，本于阴阳”（引自《素问（生气通天论》），健康与疾病共同构成了一个阴阳动态平衡的整体。故“阴阳”乃医道百病纲领，故谓“阴平阳秘，精神乃治，阴阳离决，精神乃绝”（引自《素问（生气通天论》）;张介宾亦云：“凡治病施治，必须先审阴阳，此为医道之纲领。”

“邪之所凑，其气必虚”，正气强弱与否是肿瘤发生、发展及转归的关键因素。“壮人无积，虚人常有之，脾胃虛弱，气血两虚，四时有感，皆能成积”（引自《活法机要》）。正气虚衰之时，六淫兼夹癌毒乘虚侵入，人体气血停滞，痰湿凝聚，日久成瘤。恶性肿瘤患者的基本病机因此可推测为虚实交杂，正虚为本，邪实为标。故张景岳云：“脾肾不足及虚弱失调之人，多有积聚之病。”在《外证医编》一书中也证实了此观点，其云“正气虚则成岩”。肿瘤的发生与年龄增长也呈正相关，老年患者较年轻时期更易出现经络脏腑功能紊乱、阴阳失衡、正气虚弱的情况，肿瘤发生的可能性也随之变大;《景岳全书》中“少年少见此证（噎膈），而唯中年丧耗伤者多有之”，明代（申斗垣曰“癌发四十岁上，血亏气衰，厚味过多所生”，均为其佐证。

由此可知，在推广肿瘤多学科联合诊疗的大环境下，采用中药内服、针灸外治等方法调和阴阳、固护正气，以兼顾生活质量和生存时间为原则，促使机体内环境重新平衡为目的，进而延缓肿瘤生长的趋势，是中医实现“带瘤生存”的特色。

3 在基层单位有很大推广空间的针灸疗法，兼具平衡阴阳和培补正气两大利器

针灸是以“简、便、效、廉”和安全性高为特点的中医外治法，适合在临床尤其是基层医院推广使用。在恶性肿瘤防治领域，针灸的应用范围不应局限于并发症的改善[19]和放化疗的减毒增效上[20]。典籍有云：“胞中有大疝瘕积聚……补尺泽、太溪、手阳明寸口”（引自《针灸甲乙经》）;《千金翼方》亦云“腹中积聚，皆针胞门”，均说明了针灸对肿瘤的直接攻克中占有一席之地。

“用针之要，在于知调阴和阳”（引自《灵枢（根结》），针灸发挥功效必定要以平衡阴阳为目标。针灸诊治疾病，需基于辨证论治的大前提，根据患者的八纲属性纠正阴阳偏盛偏衰，重塑“阴平阳秘”状态，恢复或维持正常功能。与方药的运用原则相同，均是在中医基本理论的指导下进行操作，但具体采用的方法有差异。针灸是结合经络腧穴的自身特性和针刺补泻原则，起到补虚泻实的作用进而调整脏腑，促使恶性肿瘤患者阴阳重新平衡。

固护正气是针灸实现“带瘤生存”的有效手段，与其他软坚散结、祛湿涤痰或清热解毒的肿瘤治法不同，该治法乃是通过对恶性肿瘤患者气血进行补益，重新激活机体“虛证”状态，进而抑制原本“活跃”的致癌因子，减少肿瘤的诱发，亦可下调恶性肿瘤中后期肿瘤细胞的浸润、扩散和转移的能力。

患者患癌时间长，则耗气伤血，导致“虚证”加重，故而能否保持“带瘤生存”状态，是由气血充足与否而定。针灸对经穴的有效刺激，对人体气血会产生一定程度的激发，遂至阴平阳秘，邪不胜正[21]。

4 针灸正向调控机体免疫功能，可能是改善肿瘤免疫抑制微环境的重要途径

免疫功能下降是恶性肿瘤发生发展的必要条件，同时也是其导致的结果。当免疫监视系统出现故障，恶性肿瘤也随之出现。譬如新生动物的胸腺切除后，形成机体的免疫抑制状态，此时若再使用病毒诱发或异种移植，才能成功实现肿瘤接种[22];不论先天性还是获得性的免疫缺陷所引起的免疫功能减弱，均可提高肿瘤的发生率[23]。同时，恶性肿瘤的侵袭也会直接造成免疫功能的减退甚或抑制，促进免疫抑制因子分泌水平的增高，降低宿主免疫能力至异常低限[24]。临床工作也发现，中晚期恶性肿瘤患者的免疫力普遍异常，一旦经治疗后病情能得到控制，免疫功能即可出现一定的恢复[25]。因此，重新激活、调动甚或改善原本正常的免疫系統，是机体实现与肿瘤“和谐共存”的方法之一，亦是肿瘤防治领域的一种折中方案。

针灸具有对机体免疫功能的正向调控作用已被学者广泛证实，以足三里为例，其为临床用于扶正固本的要穴，是足阳明胃经的下合穴。“胃者五脏六腑之海也”，脾胃互为表里经，均为人体后天之本、气血化源之地。足三里是健脾和胃、补益后天正气取穴的不二选择;临床不仅常用于胃肠道疾病的治疗，也可通过调节脾胃的运化功能，用于强壮脾胃之气，当气血生化有源时，机体正气（免疫功能）自然得到强化。

在采用针灸疗法改善肿瘤患者免疫功能的研究领域，足三里一直是首选乃至必选的穴位。有学者发现，肠癌术后使用足三里等穴位行温针灸恢复患者的胃肠功能，同时该疗法还能改善免疫细胞含量，正向调控血液中粒细胞分泌水平，以提高免疫功能[26]。对化疗患者进行辨证取穴，应用足三里不但可防治恶性肿瘤化疗所致的恶心呕吐等副作用，其还能促进患者免疫水平的提高[27]。在足三里穴位处施以温和灸法也可缓解化疗对免疫功能的抑制反应[28]。

仅一个穴位的研究即如此之多，若通过各种腧穴的合理搭配，不同针刺补泻的使用将使针灸调节机体免疫功能的可能性呈几何倍数增加。所以改善肿瘤免疫抑制状态，可能是针灸发挥“缓瘤生长”效应的主要途径。如激活T淋巴细胞相关的特异性免疫功能[29];或是直接下调调节性T细胞的水平，改善肿瘤免疫抑制微环境[30]。但相比于针灸领域的其他研究，关于针刺改善免疫功能，发挥控瘤效应的文献在数量和深度上均有明显不及，使得针灸在肿瘤领域的推广应用受到了很大的阻碍。

但无论是鉴于基层医院对开展肿瘤免疫治疗有心无力的实际情况，将针灸作为实现“带瘤生存”的补充方案，或是成为加强肿瘤免疫治疗的辅助疗法，都有必要开展针灸疗法调节肿瘤免疫功能的相关研究和理论探讨，为临床推广提供严格的有效性评价。

5 肝癌是研究针灸肿瘤免疫微环境调控机制的良好载体，与miRNA调控关系密切

因肝癌的早期症状并不明显，通常被发现时，大多数处于中晚期[31]，疾病凶险，患者常常失去了放化疗或手术的最佳时期，故临床将治疗重点多放在提高生存质量方面，反而成为研究针灸肿瘤免疫微环境调控机制的良好载体。多种miRNAs参与肝癌发生发展中，其作为一类高度保守的长度约为22个核苷酸单链RNA小分子片段[32]，不参与蛋白质的直接表达，但是可作为基因与蛋白质中间的调节器。一方面，其通过与靶mRNA3′末端非翻译区（3′-UTR）特异性结合，直接降解靶mRNA或破坏靶mRNA的稳定性，或者抑制靶mRNA的翻译，从而调控该基因的转录、翻译和表达;另一方面，miRNA通过正向调节直接作用于机体，广泛参与调控细胞的增殖、侵袭、凋亡、迁移、新生血管的形成等生理及病理的过程。miRNAs的具体作用机制是分别作为抑癌基因和促癌基因，调节肝癌细胞的发生及转移过程[33]。

常见抑癌miRNAs包括miRNA-122、miRNA-26a等。在成人的肝脏miRNAs中，miRNA-122约占70%，其可调节胆固醇的代谢，促进丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）的复制。通过研究发现去除miRNA-122后，可导致肝脏出现脂肪变性、肝炎等类似肝癌的肿瘤生长，同时促进白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）等炎症细胞浸润肝脏，导致肝癌的发生[34]。亦有研究显示，miRNA-122可直接抑制人源肝癌细胞系Hep-G2靶向mRNA的表达，并降低Hep-G2细胞受体生长及增殖速度[35]。Tsai等[36]亦证实缺乏miRNA-122小鼠，可导致小鼠出现肝纤维化及肝癌的发生，当miRNA-122重新表达，可降低肝癌的发生率，证明miRNA可抑制肝癌的发生。miRNA-26a亦可抑制肝癌细胞的生长。在肝癌的病程中，miRNA-26a通过抑制磷酸酶基因（Phosphatase gene，pten）阻止肝癌细胞的浸润/转移，并通过抑制组蛋白甲基化转移酶（Enhancer of Zeste Homolog 2，EZH2）抑制肝癌细胞增殖。在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）小鼠研究中发现，当miRNA-26a过度表达时，可明显抑制Hep-G2细胞在体内的转移能力，其通过抑制ezh2抑制Hep-G2细胞生长，并通过抑制pten抑制Hep-G2细胞的迁移和侵袭[37]。

促癌miRNAs包括miRNA-525-3p、miRNA-885-5p等。miRNA-525-3p在正常组织中表达量较小，当肝细胞发生癌变时，其表达量是正常组织的6.8～8.0倍[38]。Wang等[39]研究发现锌指核酸酶395（Zinc finger nuclease-395，ZNF395）在肝癌组织中经常被下调，过度表达ZNF395能抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。当肝脏癌变时，miRNA-525-3p并不直接通过转录因子NF-κB、MAPK通路中发挥作用，但可以通过改变PAKT分子的状态来调节PI3-K/AKT通路，抑制ZNF395的表达，ZNF395作为miRNA-525-3p的直接靶基因，miRNA-525-3p的过度表达，直接下调ZNF395的表达促进肝癌细胞迁移和侵袭。高表达的miRNA-525促进肝癌细胞迁移和侵袭[40]。miRNA-885-5p因可以激活p53蛋白并可以影响细胞生理活动，血清中的miRNA-885-5p常作为肝脏病理学的潜在生物标志物[41]。有研究发现肝癌患者血清的miRNA-885-5p的表达水平明显升高，进一步研究发现miRNA-885-5p与DICER核糖核酸内切酶具有协同作用，参与TIGAR基因表达调控。miRNA-885-5p能够促进组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化（Trimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit，h3k4me3）在细胞核中的积累，h3k4me3作为染色质及转录的生物标志物，其表达积累增加，可改变染色质构象或增加RNA聚合酶Ⅱ的活性，诱导TIGAR，启动TIGAR TSS上游区域，促进肝癌的发生及转移[42]。

6 miRNA研究技术的越趋成熟为针灸机制探索搭建了平台

随着对针灸效应机制的深入探索，目前已发现其与药物疗法的作用方式有所差异，针灸效应的靶点具有多环节、多层次、多途径等特征[43]，展现出对机体综合性的调节特点，可能并不直接针对致病因子，而是通过激活人体正向機能，展现一定的调控能力[44]。因此，以miRNA为代表，能体现“整体性”的基因组学技术似乎更有利于将针灸效应与机体功能的整体性进行有机结合，进一步清楚阐述较为复杂的针灸理论及其作用特点。

已有针灸科研团队，将miRNA作为主要研究手段，分析以其为核心的分子网络调控与针灸效应机制之间的互动意义。比如对“经络腧穴实质、针灸配穴处方、针刺补泻原则”等针灸理论的研究，尝试将miRNA为代表的遗传形式作为探析针灸“理、法、方、穴、术”的物质基础[45];或是基于miRNA研究针灸治疗某一疾病的作用机制，已涉及炎症性肠病、心肌缺血再灌注损伤、克罗恩病等多个病种，明确了针灸在治疗神经系统、消化系统、免疫系统、循环系统疾病中均扮演的重要角色[46]。

针刺效应产生与否，其影响因素极为复杂，靶点广泛，与miRNA的调控机制间的联系可能成网状分布。不同的穴位配伍或针刺补泻方案，可能调控同一个miRNA;同一种针刺处方，也可能同时改变了多个miRNAs的表达水平。所以开展相关领域的基础研究有极大的必要性，一是可作为阐释针灸作用机制的“武器”，比对不同证型或疾病间针灸干预的miRNA表达谱的异同点，为丰富针灸乃至中医药的理论内涵奉献一份力量;二是可寻找及验证针灸治疗的有效靶点，为增加针灸适宜病种开拓新的思路。

7 基于miRNA针灸调控肿瘤免疫抑制微环境的应用潜力探讨

通过直接调控肿瘤微环境及免疫功能，实现针灸延缓肿瘤生长趋势的有关研究目前相对较少，但亦颇有研究价值。比如最新发现证实，采用荷瘤周边针灸围刺的方法，联合紫杉醇，可调节一定时间内肿瘤微血管和微环境，提升瘤块局部药物浓度，黄金昶教授带领的研究团队为针灸改善肿瘤微环境提供了原创性的思路[47]。既往研究亦证实，针灸具有正向调节肿瘤免疫功能的作用，经针灸干预后获得的荷瘤小鼠血清，可促使CD4+/CD25+ Treg（Regulatory cells，调节性T细胞）细胞增殖表型相关的能力下调[48];在针刺的协助下，可加强环磷酰胺对乳腺癌小鼠肿瘤增殖的影响，同时针刺还能降低细胞毒性药物产生免疫抑制的副作用[49]。

基于上述研究成果，本研究团队以肝癌Hep-G2荷瘤裸鼠为实验对象，以表里经配穴理论为指导，联合“足三里+三阴交”阳明胃经和太阴脾经的双重效应，尝试将“针灸-miRNA-肿瘤免疫抑制微环境”进行关联，以证实电针具有延缓荷瘤生长趋势的作用。但不得不承认，该研究成果较为单薄，其中有很大的不足必须重新修正。整体评估下，Hep-G2荷瘤增殖效应的电针干预作用也相对较弱，仅体现在延缓荷瘤生长趋势方面;电针对肿瘤免疫抑制因子TGF-β1的抑制作用，是否通过miRNA进行有效调控仍待进一步明确[50-51]。

但以此为基础，却可展开多项更深入的研究。如依托肿瘤免疫抑制微环境形成的关键效应物NK细胞，其在许多肿瘤中发现存在高密度分布，经受体活化后即可通过免疫清除和免疫监视发挥抗肿瘤的功能，与患者的预后和生存率至正相关[52]。研究已经发现，针灸能增强NK细胞的活性，提高自身免疫状态[53];若能通过实验证实，针灸干预能重新激活肿瘤免疫抑制微环境中NK细胞的活性，将深入揭示电针缓瘤生长效应的生物学机制，将拓展针灸临床应用的适宜病种。

综上所述，如若能突出针灸具有的经济、安全及简便等特色优势，将使“带瘤生存”的治疗理念在基层单位有效普及。

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（收稿日期：2020-01-21）