水通道蛋白4在大鼠肺炎链球菌脑膜炎模型中的表达变化

余舒莹 祝晓飞 严俊

[摘要] 目的 觀察大鼠肺炎链球菌脑膜炎模型中水通道蛋白4（AQP4）的表达变化及调节机制。 方法 采用肺炎链球菌脑池内注射诱导建立大鼠细菌性脑膜炎模型，以注射等量生理盐水者为对照，在造模后24 h、48 h、5 d处死大鼠，用HE染色、干湿重法、荧光定量PCR和免疫印迹法（Western blot）分别检测其脑部炎症程度、脑组织含水量、AQP4 mRNA和蛋白的表达水平。采用半胱氨酰白三烯受体（CysLTs）选择性拮抗剂在造模前30 min和造模后30 min、12 h、24 h、48 h分别腹腔注射给药1次，于造模后48 h观察AQP4的表达变化。 结果 与对照组相比，光镜下可见模型组所有大鼠脑室内均有大量炎症细胞浸润，造模后48 h及5 d大鼠脑含水量显著升高（P<0.05）。PCR及Western blot结果显示，模型组大鼠脑组织AQP4 mRNA及蛋白的表达在24 h开始升高，48 h达高峰，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），5 d时又下降。CysLT2受体拮抗剂HAMI3379可显著抑制模型组AQP4的表达增加（P<0.05），而CysLT1受体选择性拮抗剂普鲁司特对模型组AQP4的表达增加无显著影响（P>0.05）。 结论 AQP4参与了大鼠肺炎链球菌脑膜炎脑水肿的形成，同时CysLT2受体可能通过对AQP4表达的调节以控制脑水肿。

[关键词] 水通道蛋白4;细菌性脑膜炎;肺炎链球菌;半胱氨酰白三烯受体

[Abstract] Objective To observe the expression changes and regulation mechanism of aquaporin 4（AQP4） in a rat model of Streptococcus Pneumoniae meningitis. Methods Intracerebral injection of Streptococcus Pneumoniae was used to induce and establish a rat model of bacterial meningitis， and the rats injected with the same amount of normal saline were collected as controls. The animals were sacrificed at 24 h， 48 h and 5 d after modeling. HE staining， dry and wet weight method， fluorescence quantitative PCR and western blot were used to detect the degree of cerebral inflammation， brain tissue water content， AQP4 mRNA， and protein expression levels. A selective antagonist of cysteinyl leukotriene receptor （CysLTs） was administered intraperitoneally once every 30 min before modeling and 30 min， 12 h， 24 h and 48 h after modeling. The expression changes of AQP4 were observed 48 h after modeling. Results Compared with the control group， under the light microscope， a large number of inflammatory cells infiltration could be seen in all rat ventricles in the model group. The brain water content of rats in the 48 h and 5 d groups were increased significantly after modeling（P<0.05）. PCR and Western blot results showed that the expression of AQP4 mRNA and protein in the brain tissue of the model group began to increase at 24 h and reached a peak at 48 h. Compared with the control group， there was a significant difference（P<0.05）， and the expression was decreased again at 5 d. CysLT2 receptor antagonist HAMI3379 could significantly inhibit the increased AQP4 expression in the model group（P<0.05）， and the selective antagonist prulast of CysLT1 receptor has no significant effect on the increased AQP4 expression in the model group（P>0.05）. Conclusion AQP4 is involved in the formation of cerebral edema due to Streptococcus Pneumoniae meningitis in rats. At the same time， CysLT2 receptor may control cerebral edema by regulating the expression of AQP4.

[Key words] Aquaporin 4; Bacterial meningitis; Streptococcus Pneumoniae; Cysteinyl leukotriene receptor

细菌性脑膜炎（Bacterial meningitis，BM）是婴幼儿时期常见的中枢神经系统严重感染性疾病[1]，炎症并发脑水肿导致的颅内压增高是患儿高致死率及发生后遗症的一个重要因素[2]，其发生机制不详。脑水平衡的调节主要与水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）有关[3]，其中水通道蛋白4（AQP4）是目前脑组织中分布最广、数量最多的水通道蛋白，参与多种脑损伤的脑水肿过程[4-5]。半胱氨酰白三烯（Cysteinyl leukotienes，CysLTs）是一类重要的炎症介质，主要通过CysLT1受体（CysLT1R）和CysLT2受体（CysLT2R）发挥作用[6-7]。研究结果显示，在大鼠肺炎链球菌脑膜炎模型中，CysLTs受体表达升高[8];脑内CysLTs和AQP4均与局灶性脑缺血后继发的脑水肿密切相关[9-11]，CysLTs可通过CysLT2受体上调AQP4表达，继而引起细胞毒性脑水肿[12]。根据上述结果，推测在细菌性脑膜炎脑水肿的发生过程中CysLTs受体与AQP4可能存在相互联系。本研究通过建立大鼠肺炎链球菌脑膜炎的动物模型，观察AQP4的表达特征及CysLTs受体拮抗剂对脑内AQP4表达的影响，初步阐明与AQP4表达调节有关的CysLTs受体亚型。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 主要试剂与仪器  肺炎链球菌Ⅲ型（中国药品生物制品检定所，菌号31003）;普鲁司特（APExBio公司）;HAMI3379（APExBio公司）;兔抗AQP4多克隆抗体（Proteintech公司）;苏木素-伊红（北京中山生物技术有限公司）;RNA提取液、RIPA裂解液、抗鼠β-actin单克隆抗体、抗兔IRdye700及抗鼠IRdye800荧光标记二抗（Servicebio公司）;立体定位仪（美国Stoeling公司）;Leica CM 1900型冰冻切片机（德国莱卡公司）;电光分析天平（上海天平仪器厂）;匀浆仪（康涛科技公司）;荧光显微镜Olympus BX51型（日本Olympus公司）;荧光定量PCR仪（ABI公司）;SDS-PAGE胶电泳转膜装置、Quantity One图像分析软件（美国BIORAD公司）;ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统（美国LICOR Biosciences公司）;手术器械、手术缝线、缝合针（华东医药有限公司），手术相关的所有物品在使用前均洗净、超声除污渍、灭菌备用。

1.1.2 实验动物  3周龄SD大鼠72只，体重50～60 g，雌雄不限，购自浙江省医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK（浙）2014-0001。本研究经医院医学动物伦理委员会审批。实验过程在屏障系统实验室中完成。

1.2方法

1.2.1 细菌悬液的制备  将肺炎链球菌Ⅲ型菌株接种于血琼脂糖培养基，在37℃ 5%CO2环境中生长过夜，再接种于肉汤中，生长至对数生长中期收菌，离心，用盐水稀释，通过紫外分光光度仪检测菌液浊度，调整菌液浓度为107 cfu/mL。

1.2.2动物分组及模型构建  ①采用PCR及免疫印迹（Western blot）法观察AQP4表达的时间特征，取40只SD大鼠随机分为对照组、模型组（造模后24 h组、造模后48 h组、造模后5 d组），每组各10只。模型组大鼠用戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，固定于立体定位仪。参照文献进行脑膜炎的诱导[13]，从大鼠小脑延髓池穿刺回抽20 μL腦脊液，模型组注入肺炎链球菌悬液20 μL（107 cfu/L），对照组注入20 μL无菌生理盐水。观察各组大鼠的临床表现，每组大鼠各取2只做病理切片检查。②为观察CysLTs受体选择性拮抗剂对细菌性脑膜炎大鼠AQP4表达的影响，取32只SD大鼠随机分为对照组、模型组、普鲁司特（CysLT1受体拮抗剂，0.1 mg/kg）干预组、HAMI3379（CysLT2受体拮抗剂，0.1 mg/kg）干预组，每组各8只。普鲁司特及HAMI 3379干预组在注入肺炎链球菌悬液前30 min、注入后30 min、4 h、12 h、24 h、48 h分别腹腔注射给药1次。对照组及模型组在注入前后相同时间点，腹腔注射相同容积的无菌生理盐水。48 h后各组大鼠均麻醉取脑。

1.2.3脑组织病理学检查  至预定的实验结束时间，将大鼠麻醉，左心室灌注生理盐水冲洗，4%多聚甲醛固定后取全脑，冠状切片石蜡包埋，切为10 μm厚的切片，进行HE染色。

1.2.4 脑组织含水量测定  采用干湿重法[14]，取左侧脑组织装入干燥称量杯中，用电光分析天平精密称量脑组织湿重，再置于100℃烤箱内持续烘烤24 h至恒重（两次测定值之差≤0.2 mg）后测定脑组织干重，计算脑含水量，脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.2.5荧光定量PCR检测AQP4 mRNA表达  各组大鼠在相应时间点麻醉，立即断头取脑，在冰面上迅速取出右侧脑组织，经液氮冻存后，置-80℃冰箱保存备用。每只大鼠取80 mg脑组织，采用Trizol试剂盒抽提总mRNA并进行逆转录，根据下列目的基因及条件进行扩增：AQP4引物，上游：5′-CAG AGA ACC CCC TAC CTG TGG A-3′，下游：5′-ATG TAG AAG ACG GAC TTG GCG A-3′，扩增片段172 bp;GAPDH引物，上游：5′-CTG GAG AAA CCT GCC AAG TAT G-3′，下游：5′-GGT GGA AGA ATG GGA GTT GCT-3′，扩增片段138 bp，95℃ 15 s、60℃ 60 s，40个循环。ΔΔCT法分析基因mRNA表达水平。

1.2.6 Western blot检测AQP4蛋白表达  每只大鼠取100 mg脑组织，以常规方法提取总蛋白并定量后，取100 μg蛋白进行硝酸纤维素膜电泳，后放入5%的脱脂奶粉中，在平缓摇动的摇床平台上室温孵育2 h。取出硝酸纤维素膜，放入混有内参β-actin单克隆抗体（1∶5000）及兔抗AQP4多克隆抗体（1∶200）的一抗中，室温孵育2 h，再用抗兔IRdye700及抗鼠IRdye800荧光标记的二抗（1∶5000）室温孵育2 h。采用ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统摄像，利用Quantity One图像分析软件分析条带灰度，结果以AQP4和内参β-actin的比值进行统计分析。

1.3统计学方法

应用Prism 5 for windows（Graph Pad Software Inc.，USA）统计学软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，采用One-way ANOVA检验，以Dunnett′s进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 对照组及模型组临床表现及HE染色结果比较

模型组大鼠在接种肺炎链球菌24 h后，均出现不同程度的神经功能缺损症状，轻者仅表现为进食少、活动少，重者表现为精神差、运动失调、拒食、抽搐、昏迷甚至死亡。其中造模后48 h组死亡1例，造模后5 d组死亡2例。对照组大鼠的精神及进食无明显异常，无上述症状。HE染色结果显示，造模组大鼠蛛网膜下腔、脑室均有大量炎症细胞浸潤，对照组大鼠未见炎症细胞浸润。见封三图1。

2.2 对照组及模型组脑含水量比较

与对照组的（72.75±2.15）%相比，模型组大鼠脑含水量在接种肺炎链球菌后48 h及5 d均显著升高，分别为（85.68±5.23）%及（84.47±4.43）%，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3对照组及模型组脑组织AQP4 mRNA表达比较

模型组大鼠脑组织AQP4 mRNA表达在感染肺炎链球菌后24 h开始有所升高，48 h达高峰，为（165.43±47.97）%，与对照组的（100.00±35.97）%及造模后24 h组的（107.34±5.58）%比较，差异有统计学意义（P<0.05）;其在5 d时又下降，为（118.10±18.68）%，但仍高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.4对照组及模型组脑组织AQP4蛋白表达比较

造模后48 h组大鼠的脑组织AQP4蛋白表达为（127.54±12.59）%，显著高于对照组的（100.00±32.37）%及造模后24 h组的（100.49±14.47）%，差异有统计学意义（P<0.05）;造模后5 d组大鼠的脑组织AQP4蛋白表达为（109.92±16.29）%，与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

2.5脑组织AQP4表达受CysLTs受体拮抗剂的影响比较

Western blot结果显示，模型组大鼠脑组织AQP4表达量为（134.03±19.38）%，与对照组的（100.00±6.41）%相比显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）;普鲁司特干预组大鼠脑组织AQP4表达量为（134.58±9.88）%，与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;HAMI3379干预组大鼠脑组织AQP4表达量为（105.90±28.31）%，与模型组相比显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

3讨论

细菌性脑膜炎是儿童常见的中枢神经系统严重感染性疾病，其中肺炎链球菌是导致脑膜炎严重神经后遗症的主要致病菌[2]。本研究采用肺炎链球菌直接注入3周龄大鼠的延髓脑池，模型组大鼠出现精神差、厌食、运动少等脑膜炎症状，同时HE染色结果显示，其脑膜及脑室内有大量炎症细胞浸润，提示大鼠肺炎链球菌脑膜炎模型建立成功。

目前已发现哺乳动物脑组织中至少分布着AQP1、AQP4和AQP9这3种水通道蛋白，这几种蛋白的分布具有细胞特异性[15]。AQP4是其中分布最广的水通道蛋白，且被证实参与多种类型中枢神经系统疾病的脑水肿，如帕金森病、创伤性脑损伤、脑卒中、癫痫、自闭症等[16]。本研究结果显示，大鼠脑含水量在脑组织感染肺炎链球菌后48 h及5 d时显著升高，与脑组织AQP4 mRNA及蛋白表达的变化基本保持一致，提示肺炎链球菌脑膜炎时脑水肿的形成与AQP4的表达增高有关。荧光定量PCR与Western blot结果显示，AQP4 mRNA表达在脑组织感染肺炎链球菌后24 h开始升高，48 h达高峰，5 d时仍持续在较高的表达水平;而AQP4蛋白表达在脑组织感染肺炎链球菌后48 h最高，5 d时已接近对照组的正常水平。提示在细菌性脑膜炎的后期，脑组织仍不断表达mRNA，而AQP4则可能被消耗用于促进脑水肿的消退。

脑水肿按发生机制主要分为细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿[17]。细胞毒性脑水肿是由于细胞能量代谢障碍导致离子泵转运失调，从而使细胞外隙的水分过度进入细胞内，引起细胞肿胀。星形胶质细胞是细胞毒性脑水肿中发生肿胀的主要细胞，其终足部位恰是AQP4在脑内高表达的位点[15]。AQP4基因敲除对肺炎链球菌脑膜炎[18]、早期局灶性脑缺血[19]等原因造成的细胞毒性脑水肿具有保护作用。研究结果显示，AQP4可促进脑损伤后细胞毒性脑水肿的形成和血管源性脑水肿的消退[20-24]。在细菌性脑膜炎脑水肿早期，AQP4可能主要参与脑水肿的形成，后期其又与脑水肿的消退有关[25]。上述研究结果为AQP4在肺炎链球菌脑膜炎脑水肿中的作用提供了直接的功能性证据，同时也提示AQP4表达调节剂在治疗细菌性脑膜炎脑水肿中具有潜在应用价值。

第一部分研究结果显示，AQP4 mRNA和蛋白的表达在脑组织感染肺炎链球菌后48 h显著升高，因此第二部分研究选取脑组织感染肺炎链球菌后48 h的大鼠作为模型组。研究结果显示，肺炎链球菌脑膜炎脑组织AQP4表达的上调可被CysLT2受体选择性拮抗剂HAMI3379抑制，而非CysLT1受体选择性拮抗剂普鲁司特，提示AQP4在细菌性脑膜炎脑水肿中的作用可能通过CysLT2受体介导。目前研究已经证实，CysLTs可通过激动CysLT1受体以增高血脑屏障通透性，从而诱导血管源性脑水肿;同时通过激动CysLT2受体以引起脑内星形胶质细胞膜上AQP4表达增加，从而诱导细胞毒性脑水肿[12]。星形胶质细胞在缺血性炎症损伤后可通过激活CysLT2受体诱导AQP4表达上调，增加的AQP4继而又加重细胞损伤[26]。因此，抑制CysLT2受体，进而抑制AQP4的功能，可能将有利于减轻细菌性脑膜炎病程中出现的细胞毒性脑水肿。另一方面，动物实验证明亚低温可能通过抑制p38 MAPK信号通路的激活，从而降低心肺复苏大鼠脑组织AQP4的表达[27]，阿托伐他汀可通过抑制p38 MAPK信号通路，减少AQP4的表达，从而减轻缺血性脑水肿[28];离体实验证明，在星形胶质细胞缺血性损伤时，CysLT2受体激活后可通过p38 MAPK信号通路参与AQP4的表达上调[26]，但细菌性脑膜炎时，CysLT2受体激活后是否通过此信号通路调节AQP4的表达，还有待进一步研究阐明。

综上所述，本研究初步确定AQP4与大鼠肺炎链球菌脑膜炎腦水肿的形成有关，同时CysLT2受体可能通过对AQP4表达的调节以控制脑水肿，以此为基础，为分子水平治疗细菌性脑膜炎脑水肿提供了新的作用靶点。

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（收稿日期：2020-02-05）