类球红细菌降解亚硝酸盐及其影响因素研究

赵志平，唐阔，吉莉莉，陈林，韩煦，王卫*

(1.成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106；2.四川轻化工大学 化学工程学院，四川 自贡 643000)

亚硝酸盐是腌腊肉制品加工中常用的食品添加剂，具有护色、抑菌、抗氧化和改善风味等作用[1-2]。李汴生等研究发现，使用亚硝酸盐加工后的烤翅色泽呈现明亮的红色，而未添加亚硝酸盐的烤翅色泽黯淡，且表面发黄[3]。亚硝酸盐的添加能显著改善萨拉米的色泽，但不同添加量对萨拉米的色泽差异影响不大[4]。刘鹏雪等研究发现，亚硝酸钠可以显著抑制哈尔滨红肠中大肠杆菌的生长，有效抑制脂肪氧化，发挥良好的

抗氧化作用[5]。亚硝酸钠的添加可以增加干腌肉中醛类物质的含量，对干腌肉亚油酸的氧化起到显著的抑制作用[6]。然而，亚硝酸盐会与生物胺反应产生具有致癌作用的亚硝胺，影响肉制品的食用安全。

使用微生物发酵剂是降低发酵食品中亚硝酸盐残留的有效途径。Kim等研究发现Pediococcusacidilactici，Pediococcuspentosaceus和Staphylococcuscarnosus能够显著降低发酵香肠中亚硝酸盐的残留[7]。Chen等研究发现，发酵剂不但能够快速降低成熟期猪肉香肠亚硝酸盐的残留，而且可以抑制肠杆菌的生长，提高了香肠的食用安全性[8]。田甜等研究发现，微生物混合发酵剂Pediococcuspentosaceus，Staphylococcuscarnosus，Staphylococcusxylosus，Debaryomyceshansenii，Lactobacillussakei可有效降低广式香肠亚硝酸盐的残留[9]。

类球红细菌富含类胡萝卜素、辅酶Q10等抗氧化活性物质[10-11]，具有多种代谢模式，易于培养，适应环境胁迫能力强，在食品和医药领域具有良好的应用前景。本研究探讨了类球红细菌发酵过程中对亚硝酸盐的降解作用及其影响因素，为类球红细菌发酵剂的开发提供了一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

类球红细菌Rhodobactersphaeroides2.4.1：本实验室保存。

1.2 主要仪器

YP302N型电子天平 上海菁海仪器有限公司；PHS-3C-01型pH计 上海三信仪表厂；水浴恒温振荡器 金坛市金南仪器制造有限公司；HC-2518台式高速离心机 湘仪设备有限公司；UV-1801紫外可见分光光度计 北京北分瑞利有限公司；EPED-E2-10TJ超纯水机 四川优普超纯科技有限公司；756PC型生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；DHP-9160B通用型超净工作台 上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 类球红细菌的活化与微氧培养

取-80 ℃保藏的菌种，在固体培养基上划线[12]，于30 ℃避光条件下培养3 d。挑取单菌落接种到40 mL培养基中(50 mL锥形瓶)，30 ℃，150 r/min，避光振荡培养至OD660为0.5～0.6。

1.3.2 类球红细菌耐受亚硝酸盐试验

1.3.3 亚硝酸盐残留分析

采用GB 5009.33-2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法(盐酸萘乙二胺法)。

1.3.4 亚硝酸盐初始浓度对类球红细菌降解亚硝酸钠的影响

1.3.5 温度对类球红细菌降解亚硝酸钠的影响

1.3.6 pH对类球红细菌降解亚硝酸钠的影响

1.3.7 溶解氧浓度对类球红细菌降解亚硝酸钠的影响

2 结果与分析

2.1 类球红细菌对亚硝酸盐的耐受性分析

随着亚硝酸钠含量的递增，类球红细菌OD660的吸光值也越来越小，生长越来越慢，见图1。

图1 类球红细菌对亚硝酸钠的耐受性分析(P<0.01)

由图1可知，添加亚硝酸钠后，类球红细菌的生长速度明显受到抑制(P<0.01)，但亚硝酸盐的浓度不超过100 mg/kg时类球红细菌仍能在相同时间内生长至对数生长期，表明类球红细菌对一定浓度的亚硝酸钠有较好的耐受性。随着亚硝酸钠含量逐渐增加，抑菌能力逐渐增强，类球红细菌的耐受能力逐渐减弱。类球红细菌对100 mg/kg的亚硝酸钠有较好的耐受性，符合食品加工过程中规定的使用量。类球红细菌全基因组已测序[13]，信息学分析表明类球红细菌基因组中不含有亚硝酸盐还原酶基因[14]，说明该菌通过其他途径降解亚硝酸盐。

2.2 类球红细菌降解亚硝酸盐分析

为探究类球红细菌对亚硝酸钠的降解性能，将类球红细菌在含有100 mg/kg亚硝酸钠的培养基中微氧培养，测定不同时间点亚硝酸钠残留，结果见图2。

图2 类球红细菌降解亚硝酸钠试验

由图2可知，随着类球红细菌培养时间的延长，培养液中亚硝酸钠的残留量逐渐降低。发酵初期亚硝酸钠降解速率较慢，发酵12 h时降解率仅为3.38%。随着发酵时间的延长，亚硝酸钠降解率逐渐上升。发酵24，36，48，60，72 h后降解率分别达到11.32%、14.19%、17.95%、18.42%、22.98%。发酵72 h时降解亚硝酸钠的能力最强，说明降解时间影响亚硝酸钠的降解率，此现象与陈曦等的研究结果类似[15]。发酵期间各微生物对亚硝酸钠的降解速率逐渐加快，可能是由于菌株生长繁殖变快，菌体密度增加，促进了亚硝酸钠的降解作用[16]。

2.3 亚硝酸盐初始浓度对类球红细菌降解亚硝酸盐的影响

由图3可知，菌株在培养12 h时，不同亚硝酸钠浓度对其降解率没有明显影响。此时，类球红细菌处于延滞期，菌体密度较低，亚硝酸钠降解率较低。随着发酵时间的延长，细菌不断生长繁殖，亚硝酸钠降解率也随之升高。随着亚硝酸钠初始含量增高，类球红细菌对亚硝酸钠的降解率出现了先升高后下降的总体趋势。这可能是由于亚硝酸钠具有一定的抑菌性[17]，随着浓度的增加，抑制了类球红细菌的生长繁殖，从而降低了类球红细菌对亚硝酸钠的降解。亚硝酸钠的初始用量分别为50，75，100，125，150 mg/kg时，降解72 h后降解率分别达到了23.21%、26.52%、21.26%、14.50%、15.70%，表明亚硝酸钠的降解率与亚硝酸钠的初始浓度有关，此现象与龚钢明等[18]和朱英莲等[19]的研究结果相似。

图3 亚硝酸盐浓度对类球红细菌降解亚硝酸盐的影响Fig.3 The effect of substrate concentration on the degradation of nitrite by Rhodobacter sphaeroides

2.4 温度对类球红细菌降解亚硝酸盐的影响

温度对类球红细菌降解亚硝酸盐有较大的影响，结果见图4。

图4 温度对类球红细菌降解亚硝酸钠的影响

由图4可知，培养12 h时，不同温度对亚硝酸钠的降解率没有显著性变化，亚硝酸钠降解率均较低。随着时间的延长，亚硝酸钠的降解率均不断升高，20，25，30，35 ℃发酵72 h后，降解率分别达到20.20%、31.80%、33.66%、35.98%，表明温度对类球红细菌降解亚硝酸钠有显著影响，此现象与王爽等[20]和张二康等[21]的结果相似。

2.5 pH对类球红细菌降解亚硝酸钠的影响

pH对类球红细菌降解亚硝酸钠有较大的影响，见图5。

图5 pH对类球红细菌细菌降解亚硝酸盐的影响

由图5可知，培养12 h时，pH对亚硝酸钠的降解率没有显著的影响。随着培养时间延长和初始pH增大，亚硝酸钠降解率呈现先升高后降低的趋势。在72 h后，初始pH为6.0，6.3，6.6，6.9，7.2时，降解率分别达到了26.62%、27.21%、21.11%、20.40%、18.20%。pH为6.0和6.3时，亚硝酸钠的降解率较高，说明pH影响类球红细菌降解亚硝酸钠，此现象与刘玉廷等[22]和苏容容等[23]的研究结果相似。

2.6 溶解氧对类球红细菌降解亚硝酸钠的影响

由图6可知，在摇床转速不变的情况下，通过改变锥形瓶中培养液的体积以改变培养液中的溶解氧。培养12～48 h时，随着溶解氧的降低，亚硝酸钠的降解率没有发生显著性变化。48 h后随着时间逐渐增加，亚硝酸钠降解率均不断地升高，发酵72 h时装液量为40%、50%、60%、70%、80%的降解率分别达到了20.89%、23.14%、26.73%、25.43%、34.65%。装液量范围在70%～80%，培养72 h，亚硝酸钠降解率较高，说明溶解氧对细菌降解亚硝酸钠具有较大的影响，此结果与Kampman等[24]和Sun等[25]的研究结果类似。

图6 溶解氧对类球红细菌降解亚硝酸盐的影响

3 结论

本研究探讨了类球红细菌对亚硝酸盐的降解作用以及影响因素。类球红细菌对亚硝酸盐具有较好的耐受性，在100 mg/kg的亚硝酸盐胁迫下能够较好地生长。随着发酵时间的延长，类球红细菌降解亚硝酸盐的效率得以提高。类球红细菌对亚硝酸盐的降解受温度、pH、亚硝酸盐初始浓度和溶解氧等因素的影响。本研究为类球红细菌降解亚硝酸盐提供了一定的理论基础。