基于网络药理学研究鬼箭羽治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制

李相国，雷明豪，胡泽华，涂世伟，曹知勇，黄德斌

湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000)

缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)是由脑血管狭窄或闭塞引起局部脑组织缺血、缺氧坏死，导致一系列的临床综合征。本病多发于中老年，具有较高的致残率和致死率[1]。当前的治疗原则是尽快通过溶栓或机械方式恢复血流再通，但血流再灌注同时可能导致脑组织损害进一步加重，即脑缺血再灌注损伤(Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury，CIRI)[2]。CIRI的病理机制目前尚未完全明确，当前研究认为与Ca2+超载、氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等有关[3]。尽管目前治疗CIRI的药物不断应用于临床，但效果并不尽人意。而以多成分、多靶点、多协同为特点的传统中药，逐渐成为当今研究的热点。

鬼箭羽(GJY)首次记载于《神农本草经》，系卫矛科植物卫矛(EuonymusalatusThunbsieb)的羽或带羽的枝条。味苦、性寒，归肝、脾经。历代医籍中多有记载，有活血通经，祛风杀虫的功效[4]。现代医学研究表明[5]GJY含有丰富的黄酮类、甾体类、生物碱等化合物。具有抗炎、抗氧化、降血脂等作用。GJY在临床上可单用或配伍其他中药治疗脑卒中等脑血管疾病，具有良好的疗效，但其作用机制尚不完全清楚，需进一步系统探索。

网络药理学是在系统生物学和计算机技术高速发展的基础上建立的新学科。利用现代信息化手段，通过挖掘蛋白、基因、疾病等数据库，使用专业数据分析平台和软件，系统地分析研究并明确中药复杂多成分与机体复杂多靶点之间的相互关联[6]。本研究运用网络药理学，系统探究了GJY治疗CIRI的可能分子作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1GJY活性成分及靶点筛选通过中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP；https://tcmspw.com/tcmsp.php)，检索出GJY的所有活性成分。参照文献报道[7]的口服生物利用度(Oral Bioavai Lability，OB)≥30%、类药性(Drug-Likeness，DL)≥0.18为限定条件进行筛选，获得GJY候选生物活性化合物。运用TCMSP平台对入选成分进行相关靶点检索，获得药物潜在作用靶点。应用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)，将靶点校正为标准基因名称。

1.2CIRI靶点的筛选以“Cerebral ischemia-reperfusion injury”为关键词，在人类基因注释数据库(GeneCards,https://www.genecards.org/)和在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/)中进行检索，将所得基因合并，去除重复值后，得到疾病基因靶点。在Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平台绘制韦恩图。

1.3构建“GJY-成分-CIRI-靶点”网络将药物活性成分和药物与疾病交集的蛋白靶点导入Cytoscape 3.7.2中，进行网络可视化，并进行数据分析。

1.4构建PPI网络与核心靶点筛选在String数据(https://string-db.org/)中输入交集靶基因，选择交互作用阈值>0.4，构建GJY对CIRI靶点的PPI网络。采用Cytoscape 3.7.2中的cytoHubba模块进行核心靶点筛选。

1.5富集分析将共同作用靶点输入Metascape(http://metascape.org/)平台，进行基因本体(Gene Ontology，GO)分析以及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，保存结果。设定阈值P<0.01，并根据富集基因显著程度，筛选出排名前20名条目，在微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制气泡图并分析。

2 结果

2.1GJY活性成分及靶点获取TCMSP数据库检索初步筛选得到24个活性成分，按照OB≥30%和DL≥0.18的筛选条件，最终获得8个候选活性成分。TCMSP平台共检索到潜在作用靶点180个。通过Uniprot数据库将药物靶点转化为标准基因名称。其中，有7个蛋白靶点未找到标准基因，去除重复基因后共得99种标准基因纳入研究，见表1。

表1 鬼箭羽候选活性成分

2.2CIRI靶点的筛选以“Cerebral ischemia-reperfusion injury”为关键词，在GeneCards数据库和OMIM数据库中检索到靶基因1 008个和84个。将两者数据合并去重后，最终得到1 085个靶基因。通过Venny 2.1.0平台制作韦恩图，获得共同作用靶点56个,见图1。

图1 鬼箭羽-脑缺血再灌注损伤靶点韦恩图

2.3构建“GJY-成分-CIRI-靶点”网络运用Cytoscape 3.7.2软件构建“GJY-成分-CIRI-靶点”网络。该网络共由66个节点和154条边组成。利用Cytoscape中Network Analyzer进行拓扑分析，化合物度值排名前3位的是槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)和β-谷甾醇(beta-sitosterol)，度值分别为47、21、13。根据靶点Degree值排名前3位的是前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)和磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚单位γ(PIK3CG)，度值分别为7、6、5。此网络分析所筛选到排名靠前的化合物和靶点可能为GJY治疗CIRI的核心化合物和核心靶点，见图2。

注：三角形节点：疾病；六角形节点：药物；圆角矩形节点：活性化合物；圆形节点：关键靶点；每条边：药物、化合物和靶点之间的相互作用关系图2 “GJY-成分-CIRI-靶点”网络

2.4GJY治疗CIRI的PPI网络构建与关键靶点筛选将共同靶点导入String数据库，选择交互作用阈值>0.4，构建PPI网络。本网络中，共有56个节点(node)，492条边，平均节点度为17.6，平均局部聚类系数为0.707，见图3。

图3 PPI网络构建图

PPI网络中存在着部分密度较高的区域，需进一步筛选其内在关键靶点。故使用Cytoscape软件中的cytoHubba模块进行网络分析并筛选度值，将排名前10位的基因靶点作为GJY防治CIRI的关键基因，并构建关键靶点蛋白互作网络。该网络中节点颜色默认按度值从低到高，由黄色向红色渐变，展现了PPI网络中关键靶点的蛋白相互关系及其重要性排序，见图4。

图4 关键靶点蛋白互作网络

2.5GJY治疗CIRI的GO分析通过Metascape在线工具对56个交集靶点进行生物学及通路分析。结果显示，共有1 245个GO术语显示富集，其中生物过程(Biological Process，BP)1 144个，细胞组分(Cellular Component，CC)42个，分子功能(Molecular Function，MF)59个，KEGG富集到有110条信号通路。按照富集的显著程度取排名前20名的条目绘制气泡图。每张图左侧为排名靠前的富集名称，气泡颜色由绿到红代表Q值(Q Value)从小到大，气泡越大代表该通路的基因计数(Count)越大，横轴代表该通路基因所占总体输入基因的比率(Ratio)。

GO分析显示，在生物过程方面，这些靶点主要涉及细胞对氮化合物的反应(cellular response to nitrogen compound)、细胞因子介导的信号通路(cyto-kine-mediated signaling pathway)、活性氧的代谢过程(reactive oxygen species metabolic process)、活性氧生物合成过程(reactive oxygen species biosynthetic process)等生物过程(图5A)。细胞组分方面主要涉及膜微结构域(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、膜筏(membrane raft)等组分(图5B)。分子功能方面，靶点涉及氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)、蛋白质同聚活性(protein homodimerization activity)、辅助因子结合(cofactor binding)等分子功能，见图5C。

KEGG通路分析结果显示，GJY治疗CIRI的通路主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)、血小板激活(Platelet activation)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等(图5D)。

注：5A:GO-BP分析；5B:GO-CC分析；5C:GO-MF分析；5D:KEGG分析图5 鬼箭羽治疗CIRI的生物功能与通路富集分析(GO和KEGG气泡图)

3 讨论

CIRI在中医学中属于“中风”范畴，中风病的发生多由素体气血不足，复感外风侵袭，引动内风或劳倦、情志等诱因造成脏腑功能失调，而导致气血运行失常，血溢脉外或痰浊、瘀血等产物痹阻脉络，从而诱发昏仆、半身不遂等症[8]。GJY历代医籍中多有记载，其功效在早期以治疗妇科经血疾病为主，随着历代医家的不断临床实践，认为活血祛瘀是其主要功效，近代医者较多用于治疗高血脂、高血糖及心脑血管等疾病[5]。在临床应用及文献报道中，GJY治疗对脑血管疾病疗效确切，但在基础实验研究方面尚欠缺分子生物学验证[9]。

本研究发现，通过TCMSP数据库筛选出GJY化学成分24种，按照OB和DL限制条件筛选后入选8个化学成分，4个为黄酮类化合物(槲皮素、山柰酚、柚皮素、橙皮苷)，1个为四环三帖类化合物(β-谷甾醇)。结果表明GJY治疗CIRI的化合物度值排名前3位的是槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇，可能是其发挥效应的主要有效成分。槲皮素和山柰酚具有抗炎、抗氧化和保护心脑血管等药理作用[10]。研究表明[11]槲皮素可减轻CIRI大鼠模型的脑水肿及血脑屏障功能障碍，而起到脑保护作用。槲皮素还可通过减轻氧化应激、改善线粒体代谢、抑制炎症反应，激活PI3K/Akt通路降低神经细胞的自噬和凋亡而减轻脑组织损伤[12]。山柰酚对CIRI也具有良好的保护作用，其机制与减轻氧化应激、炎症反应，保护血脑屏障，减少脑细胞凋亡有关[13]。β-谷甾醇是一种常见的植物甾醇，具有良好的抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等药理活性[14]。研究表明[15]β-谷甾醇可明显增强蒙古沙土鼠CIRI的运动协调性，并能促进扣带皮层和隔区的血管再生。

前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)是前列腺素合成的关键酶，可分为PTGS1和PTGS2两种亚型。PTGS及下游产物与机体的炎症、应激、凝血、肿瘤等多种生理和病理过程关系密切[16]。本研究通过药物和CIRI基因靶点的网络构建，根据度值得到排名前3的靶点基因，分别为PTGS2、PTGS1、PIK3CG。同时在PPI网络的关键靶点筛选中PTGS2也为其关键靶点之一。研究表明[17]在IS患者中PTGS2呈高表达状态，使用PTGS2抑制剂降低PTGS2的活性，可以减轻炎症反应，保护缺血区脑组织。研究表明[18]在大动脉粥样硬化型脑梗死患者中PIK3CG呈现高表达。Jin等[19]首次通过研究证明PIK3CG在CIRI诱导血脑屏障破坏和脑组织损伤中起重要作用。筛选得到的核心靶点基因中主要与合成前列腺素有关，因此推测GJY治疗CIRI的作用机制，可能与炎症反应有关。

通过化合物和靶点之间的网络关系可得知，GJY的一种化合物可同时作用多个靶点，而同一个基因靶点又可受到多个化合物的调控，表明GJY与CIRI是通过多成分、多靶点之间相互影响、相互协同而发挥作用的。

GO分析结果表明，GJY可能是通过调控细胞对氮化合物的反应、细胞因子介导的信号通路、活性氧的代谢和合成过程等生物学途径而发挥防治CIRI效应。炎性细胞因子在CIRI的病理过程中扮演重要角色。在脑缺血过程中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)等炎性因子可促使白细胞向缺血区浸润,释放炎性介质，使脑组织损伤进一步加重[20]。低浓度活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)可作为细胞内的信号分子在组织缺血时参与血管生成和组织修复[21]。研究表明[22]大量活性氧可激活多条信号通路,通过调节机体内在凋亡途径，引起神经细胞凋亡。因此，推测GJY治疗CIRI的作用是通过调控炎症细胞因子、氧氮分子在体内的过程等多种生物途径而发挥作用的。

KEGG通路富集结果显示，GJY治疗CIRI的信号通路主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF、NF-κB等。动脉粥样硬化是导致IS的重要发病机制，流体剪切应力可引起血管内皮细胞中炎症因子和凋亡基因的表达,从而诱导炎症、细胞迁移及白细胞黏附等,导致血管重塑和动脉粥样硬化的发生[23]。研究证明[24]炎症反应在CIRI的病理过程中起着关键性的作用，其中TNF和NF-κB是调节炎症反应的重要通路。当CIRI发生后可使NF-κB通路激活，引起多种炎性因子的表达(如TNF-α、IL-6等)，而大量产生的TNF-α、IL-6等又可反过来激活NF-κB通路，使脑组织的损伤进一步加重[25]。除以上信号通路外，HIF-1信号通路、血小板活化和钙信号通路等均参与了GJY治疗CIRI的病理生理过程，表明GJY治疗CIRI是通过调控多个信号途径相互作用的结果。但考虑到以上多条炎症通路参与了本次通路富集结果，并与本研究PPI筛选的关键靶点TNF、IL-6和IL-1β之间存在密切联系。因此，在未来开展GJY的进一步组方及药理研究中，可作为重要分子通路的研究方向。

综上所述，GJY可通过多成分、多靶点、多通路而发挥治疗CIRI作用。但本次研究也存在一定不足，如按照限制条件，过滤掉的部分化合物可能与疾病间存在着某种相关性，再者各数据库间可能存在着数据不一致，而造成结果差异的产生。