宫颈癌病人血清微小RNA-145表达及与人乳头瘤病毒16型感染的关系

宫颈癌是一种发于子宫颈部的妇科常见恶性肿瘤，多发于40～60岁女性群体，其病死率高居妇科肿瘤第二。由于病毒感染、生活习惯、性行为、妊娠、分娩、经济条件等影响，我国宫颈癌发病率呈上升趋势。虽然近年来关于宫颈癌相关研究较多，但病人病死率仍处于较高水平，早期有效诊断有助于提高宫颈癌治疗效果和改善病人预后。人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染与宫颈癌密切相关，经调查研究发现，高危型HPV之一的人乳头瘤病毒16型（HPV16）感染是我国宫颈癌发生的主要影响因素。Hong等研究表明，高水平的HPV16载量预示宫颈癌恶性程度加深。有研究发现，随着HPV16阳性率升高，宫颈癌病人的国际妇产科联合会（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期升高、病死率增大。有研究报道，微小RNA-145（Micro ribonucleic acid-145，miR-145）在非小细胞肺癌细胞系中表达下调，过表达miR-145可能通过抑制上皮间充质转化过程抑制癌细胞迁移和入侵，发挥抑癌作用。段亚男等研究报道，肺腺癌病人血清miR-145表达水平明显降低，与TNM分期、病理分级、淋巴结转移等密切相关。由于宫颈癌血清中miR-145与宫颈脱落细胞HPV关系未见报道，本研究通过检测宫颈癌病人血清miR-145表达水平，分析与病人临床病理特征及HPV感染关系，探究其对宫颈癌诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年5月至2019年5月三亚市中医院收治的宫颈癌病人83例，年龄范围为37～78岁，年龄（51.34±16.18）岁。纳入标准：①经病理切片及临床诊断，确诊为宫颈癌。②均为首次患癌，且临床及病理资料完整。③入组前未进行放、化疗及药物治疗。④病人及其近亲属同意并签署知情同意书。排除标准：①合并患有其他部位肿瘤。②患有其他生殖系统疾病。③合并患有高血压、糖尿病者。④妊娠期或哺乳期病人。根据FIGO分期系统，将入组病人分为：鳞癌47例，腺癌36例；根据肿瘤直径分为：＜4 cm 34例，≥4 cm 49例；根据分化程度分为：高、中分化40例，低分化43例；根据间质浸润深度分为＜1/2 45例，≥1/2 38例；根据是否发生淋巴结转移分为：无淋巴结转移72例，有淋巴结转移11例。另选取同期在该院体检显示健康者83例为对照组，对照组对本研究知情并签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 主要仪器和试剂

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRTPCR）仪（型号7900，美国Applied Biosystems公司）、普通PCR仪（型号GT9612，无锡百泰克生物技术有限公司）、电泳仪（型号1658001，美国伯乐公司）、qRT-PCR试剂盒（批号RR820A，宝日医生物技术有限公司）、多重PCR试剂盒（批号N555-KIT，美国Amresco公司）、RNA提取试剂盒（批号R1200-100，北京索莱宝科技有限公司）、DNA提取试剂盒（批号D3892-02，美国Omega公司）。

1.3 方法

1.3.1

样本采集 所有入组者于入院时清晨（7：00—9：00）空腹采集外周静脉血5 mL，4℃、3 000 r/min条件下离心20 min后收集上清液，分装于无菌EP管中，保存于-80℃超低温冰箱备用。

所有入组者于宫颈脱落细胞检查时，使用宫颈刷采集宫颈脱落细胞，置于pH 7.0的PBS缓冲液中静置后，在4℃、3 000 r/min条件下离心20 min富集细胞，保存于-80℃超低温冰箱备用。

1.3.2

miR-145、人乳头瘤病毒16型E6蛋白（HPV16 E6）mRNA表达水平检测 采用qRT-PCR检测所有入组者血清miR-145及宫颈脱落细胞HPV16 E6 mRNA表达水平。使用RNA提取试剂盒（Trizol法）提取总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录，所得互补DNA（cDNA）用于qRT-PCR实验。qRT-PCR反应体系（20µL）如下：cDNA 2µL，正、反向引物各0.8µL，反应混合物（Mix）10µL，荧光基团（ROX）0.4µL，无酶水6.0µL。具体反应步骤如下：95℃、36 s，1循环；95℃、5 s；62℃、34 s，40循环。每个样本重复3次，用2法计算血清miR-145和宫颈脱落细胞HPV16 E6 mRNA表达水平。qRTPCR实验所用引物如表1所示。

1.3.3

HPV16感染水平检测 采用多重PCR技术检测HPV16 E6 DNA表达水平。使用DNA提取试剂盒和PCR试剂盒提取宫颈脱落细胞DNA并进行PCR实验，所得产物进行凝胶电泳成像。若HPV16 E6 DNA为阳性则判定HPV16为阳性。

表1 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）引物序列

2 结果

2.1 两组一般资料对比

两组年龄、已婚比例、怀孕次数＞2比例、绝经比例比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。宫颈癌组病人流产次数＞1比例显著高于对照组（

P

＜0.05）。见表2。

2.2 两组血清miR

-

145及宫颈脱落细胞HPV16感染水平比较

宫颈癌组血清miR-145水平显著低于对照组（

P

＜0.05），宫颈脱落细胞HPV16阳性率及HPV16 E6 mRNA表达水平明显高于对照组（

P

＜0.05），见表3。

表3 健康体检者与宫颈癌血清miR-145水平及人乳头瘤病毒16型（HPV16）感染水平比较

2.3 血清miR

-

145水平与宫颈癌病人临床病理特征关系

年龄、病理类型、肿瘤直径、间质浸润深度与病人血清miR-145水平比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。不同分化程度病人血清miR-145水平比较，差异有统计学意义（

P

＜0.05）。FIGO分期Ⅲ/Ⅵ期、有淋巴结转移、HPV16阳性病人血清miR-145水平明显低于FIGO分期Ⅰ/Ⅱ期、无淋巴结转移、HPV16阴性病人（

P

＜0.05）。见表4。

表4 宫颈癌83例血清miR-145水平与临床病理特征关系/±s

2.4 宫颈癌病人血清miR

-

145与HPV16 E6 mRNA表达水平相关性

如图1所示，宫颈癌病人血清miR-145与宫颈脱落细胞中HPV16 E6 mRNA表达水平呈负相关（

r

=-0.372，

P

=0.001）。

2.5 影响宫颈癌发生危险因素分析

以年龄、绝经、怀孕次数、流产次数、HPV16水平、miR-145水平为自变量，以宫颈癌是否发生为因变量建立非条件logistic回归模型，赋值1=发生，0=未发生，检验水准为

α

=0.05。logistic回归分析结果显示，年龄≥51、绝经、怀孕次数＞2与宫颈癌发生无关（

P

＞0.05）。流产次数＞1、HPV16阳性、miR-145低表达是影响宫颈癌发生的独立危险因素（

P

＜0.05）。见表5。

表2 健康体检者与宫颈癌一般资料对比

图1 宫颈癌83例miR-145与人乳头瘤病毒16型E6蛋白（HPV16 E6）mRNA表达水平相关性

2.6 miR

-

145对宫颈癌诊断价值

ROC曲线分析显示，miR-145预测宫颈癌发生的曲线下面积为0.887，灵敏度为85.50%，特异度为86.70%，见图2。

图2 miR-145对宫颈癌83例诊断效能

3 讨论

宫颈癌病人早期无明显症状，可能出现轻微阴道出血、阴道排液和性交痛等，只能通过临床检测诊出。但多数病人由于筛查不及时而使病情进展至中晚期，主要症状有不规则阴道出血、排液、下肢肿痛，引起其他器官病变如尿毒症等，生存率极低。早期诊断可使病人进行及时有效治疗，提高生存率和生活质量。有研究报道，吸烟、被动吸烟、人工流产次数增加、过早生育等因素可能增加宫颈癌发生风险。本研究结果显示，宫颈癌组病人流产次数＞1比例显著高于对照组，提示流产次数增加可能影响宫颈癌发生。

HPV是一种环状DNA病毒，有8个开放阅读框，包括编码区和非编码区。HPV与多种人类生殖系统感染类疾病有关。HPV16属于高危型HPV，参与宫颈炎、子宫肌瘤、宫颈癌等疾病进展。有研究表明，宫颈脱落细胞中HPV16检出率随病变程度提高而升高。本研究结果显示，宫颈癌病人宫颈脱落细胞HPV16阳性率明显高于对照组，提示HPV16可能与宫颈癌发生有关。Baedyananda等研究报道，HPV16靶蛋白E1在宫颈癌组织中表达水平升高，与疾病进展密切相关，可能作为宫颈癌预后标志物。有研究证实，HPV E6在人宫颈角化细胞致瘤转化过程中发挥重要作用。本研究结果显示，宫颈癌病人宫颈脱落细胞HPV16 E6 mRNA表达水平明显高于对照组，提示HPV16可能通过影响癌细胞增殖，影响宫颈癌发展。

微小RNA是一类具有调控功能的短链非编码RNA，与疾病进展有关。Zhong等研究发现，miR-1225在胰腺癌细胞中表达下调，miR-1225过表达增加了胰腺癌细胞凋亡。Tan等研究报道，乳腺癌细胞中miR-708表达水平降低，与病人化疗反应和预后不良有关，在癌细胞自我更新和耐药中发挥抑癌作用。提示miRNA参与肿瘤发生发展。有研究报道，miR-145在宫颈癌中表达水平低于正常组织，与FIGO分期晚期、淋巴结转移和病人生存率低有关，可能是宫颈癌潜在预后标志物。本研究结果显示，miR-145在宫颈癌病人血清中表达水平显著低于对照组，且与肿瘤分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关，与Azizmohammadi等研究结果一致，提示miR-145可能与宫颈癌发生发展有关。Yin等研究证实，miR-145可能通过抑制转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）蛋白表达，抑制上皮间充质转化，减少非小细胞癌细胞迁移和侵袭，抑制肿瘤形成。提示miR-145可能通过影响TGF-β诱导的上皮间充质转化，参与宫颈癌进展。

表5 宫颈癌发生危险因素的166例logistic回归分析

Tao等研究报道，口咽鳞状细胞癌中TGF-β可能通过调控HPV16水平，影响癌症发生风险。Liu等在非小细胞肺癌研究中表明，HPV16 E6蛋白在癌细胞中通过上调上皮间充质转化水平，促进癌症发生发展。本研究发现，HPV16阳性病人血清miR-145水平明显低于HPV16阴性病人，且宫颈癌病人血清miR-145与宫颈脱落细胞HPV16 E6 mRNA表达水平呈正相关，提示miR-145可能通过TGF-β调控HPV16水平，影响上皮间充质转化过程，促进宫颈癌发生发展。

本研究还发现，流产次数＞1、HPV16阳性、miR-145低表达是影响宫颈癌发生独立危险因素，且miR-145预测宫颈癌发生的曲线下面积为0.887，灵敏度为85.50%，特异度为86.70%，诊断价值较高。进一步提示miR-145低表达可能作为早期宫颈癌诊断标志物，为临床诊治宫颈癌提供一定帮助。

综上所述，与对照组相比，宫颈癌组血清miR-145水平显著降低，宫颈脱落细胞HPV16阳性率及HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高，miR-145可能与HPV16相互作用，共同影响宫颈癌发生发展。但由于本研究样本量较少，研究较为基础，具体机制尚需进行大量实验进一步验证。