黏蛋白1基因小干扰RNA联合丙泊酚抑制肺癌H460细胞生长的机制研究

肺癌占男性所有恶性肿瘤的发病率和死亡率的第一位，在女性中排名第二。肺癌的高发病率和死亡率与肺癌细胞的生物学行为的改变密切相关。肺癌的基因疗法，近年来发展迅速，其中一些已进入临床试验。黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）是一种大的跨膜蛋白，具有N末端（MUC1-N）和C末端（MUC1-C）两个亚基。以往研究显示，MUC1在多种肿瘤中过表达，且参与癌症发生、发展、转移和侵袭等的调节。先前的研究表明MUC1可能是肺癌治疗的新靶点，并且可能参与肺癌细胞生长的调节。然而，MUC1在肺癌进展中的具体作用机制仍然知之甚少。丙泊酚是临床上常用的一种麻醉诱导和维持的药物，近年来发现其具有广泛的抗癌特性。研究显示，丙泊酚能够明显抑制多种肿瘤细胞的生长。然而敲低MUC1基因表达与丙泊酚联合作用于肺癌是否具有协同抑制肺癌细胞生长的作用目前尚不清楚。因此，本研究于2018年12月至2019年6月通过RNA干扰技术敲低MUC1的表达及丙泊酚单独或联合干预肺癌H460细胞，观察对H460细胞生长的影响并探讨其可能的机制，以期为肺癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌H460细胞（中国科学院上海细胞库）；丙泊酚（英国AstraZeneca公司，批号GD187）；胎牛血清（美国HyClone公司）；RPMI-1640培养基（美国）；转染试剂Lipofectamine 2000、Trizol试剂（赛默飞世尔公司）；细胞计数试剂盒（CCK-8）试剂、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；特异性MUC1小干扰RNA（siRNA）和阴性对照siRNA Control（广州锐博生物科技有限公司）；反转录试剂盒（日本TaKaRa公司）；SYBR Green PCR Master Mix实时荧光定量PCR（qPCR）检测试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；ECL发光试剂（上海爱必信生物科技有限公司）；MUC1抗体、增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗体、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗体、p-Akt抗体及辣根过氧化酶标记的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（美国Abcam公司）。

主要仪器：流式细胞仪（上海默瑞生物），型号Partec；多功能酶标仪（美谷分子仪器），型号spectra-MAXM5；高速离心机（日本日立公司），型号CR21GⅡ。

1.2 细胞培养

人肺癌H460细胞在含10%灭活胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L链霉素的RPMI-1640培养基中培养，放置在5%二氧化碳、37℃恒温培养箱中，在倒置显微镜下观察H460细胞生长状态，及时更换新鲜培养液，待细胞贴壁生长融合度达90%以上时使用胰蛋白酶传代，实验选择对数增殖期的H460细胞。

1.3 特异性MUC1 siRNA转染H460细胞

对数生长期的H460细胞以胰酶消化后，收集细胞并种植到6孔板中，于37℃培养箱继续培养，转染前1 d将培养液更换成不含血清及双抗的培养液，待细胞汇合度为50%左右时进行转染，采用Lipofectamine 2000转染试剂分别将特异性MUC1 siRNA和阴性对照siRNA Control转染至H460细胞，将转染MUC1 siRNA的H460细胞命名为si-MUC1组，转染siRNA Control的H460细胞命名为si-NC组。

1.4 qPCR检测H460细胞中MUC1 mRNA表达水平

分别收集转染48 h后si-NC组和si-MUC1组H460细胞，加入Trizol试剂提取细胞中总RNA，按照反转录试剂盒说明书加样并合成cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix qPCR检测试剂盒进行qPCR检测。以相对定量2法分析各组H460细胞中MUC1 mRNA相对表达水平。

1.5 蛋白质印迹法（Western blotting）检测H460细胞中MUC1蛋白表达水平

收集转染48 h后各组H460细胞，分别加入RIPA细胞裂解液，在冰上裂解30 min提取细胞中总蛋白，BCA蛋白浓度检测试剂测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，沸水中加热使蛋白变性，取等量蛋白样品，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，封闭（5%脱脂奶粉）2 h，分别配置一抗，加入相应一抗、二抗，室温孵育2 h。加入ECL显色试剂，成像，使用凝胶成像系统拍照，以GAPDH为内参，采用Image J图像分析软件分析条带灰度值，计算各组H460细胞中MUC1蛋白相对表达水平。

1.6 丙泊酚对H460细胞活力的影响

对数生长期的H460细胞以5×10个/孔接种到96孔板中，待细胞长满底部70%以上时，分别加入不同浓度（0、12.5、25.0、50.0、100.0µmol/L）的丙泊酚干预H460细胞48 h，向每孔细胞中加入10µL CCK-8试剂，继续孵育4 h，采用全自动酶标仪测定波长在450 nm处吸光度值。计算细胞活力=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。根据细胞丙泊酚对H460细胞活力的影响计算丙泊酚半数致死浓度。

1.7 实验分组

以丙泊酚半数致死浓度为实验加药标准浓度分组：si-NC组、si-MUC1组、Propofol组和si-MUC1+Propofol组。将转染MUC1 siRNA的H460细胞命名为si-MUC1组，转染siRNA Control的H460细胞命名为si-NC组，将55.96µmol/L的丙泊酚干预的H460细胞命名为Propofol组，将转染MUC1 siRNA联合55.96µmol/L的丙泊酚干预的H460细胞命名为si-MUC1+Propofol组。

1.8 CCK

-

8法检测H460细胞增殖能力

对数生长期H460细胞按照上述“1.7”方法分组处理，24、48、72 h后采用CCK-8法检测各组H460细胞吸光度值（

λ

=450 nm）。

1.9 细胞克隆形成实验

si-NC组、si-MUC1组、Propofol组和si-MUC1+Propofol组H460细胞分别以500个/孔接种到6孔板中，将6孔板放置到37℃培养箱中继续培养14 d，直至细胞克隆形成。使用4%多聚甲醛固定30 min，在使用0.1%结晶紫染色20 min，洗去染液，风干后在倒置显微镜下随机取5个视野观察，判断细胞克隆形成情况并计数大于50个克隆数的集落，实验重复3次。

1.10 Western blotting检测各组H460细胞中PCNA、cyclin D1、Akt和p

-

Akt蛋白表达水平

分别收集处理48 h si-NC组、si-MUC1组、Propofol组和si-MUC1+Propofol组H460细胞，加入细胞裂解液并提取细胞中总蛋白，按照方法“1.5”检测各组细胞中PCNA、cyclin D1、Akt和p-Akt蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 MUC1 siRNA转染对肺癌H460细胞中MUC1表达的影响

分别将MUC1特异性siRNA及阴性对照转染至肺癌H460细胞，qPCR和Western blotting检测结果如图1所示，si-NC组和si-MUC1组细胞中MUC1 mRNA的表达分别为：（1.00±0.10）、（0.18±0.02），MUC1蛋白表达分别为：（0.56±0.06）、（0.21±0.02），与si-NC组比较，si-MUC1组H460细胞中MUC1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低（

t

=24.122，

P

＜0.001，

t

=16.602，

P

＜0.001）。提示转染MUC1 siRNA能够有效敲低H460细胞中MUC1基因表达。

图1 蛋白质印迹法检测肺癌H460细胞中黏蛋白1（MUC1）蛋白表达水平

2.2 丙泊酚对H460细胞活力的影响

采用不同浓度（0、12.5、25、50、100µmol/L）的丙泊酚干预H460细胞48 h，CCK-8检测结果显示，0、12.5、25、50、100µmol/L的丙泊酚干预H460细胞活力分别为（100±5.17）%、（90.26±5.22）%、（73.38±4.14）%、（50.51±3.81）%、（34.62±3.24）%，丙泊酚对H460细胞活力有不同程度的抑制作用（

t

=12.879、23.943、31.630，均

P

＜0.05），且具有一定的剂量依赖性。根据丙泊酚对H460细胞活力的影响，计算丙泊酚半数致死浓度为55.96µmol/L，因此后续选取浓度为55.96µmol/L的丙泊酚作用实验加药浓度。

2.3 MUC1 siRNA联合丙泊酚对H460细胞增殖的影响

CCK-8实验分析结果如表1所示，与si-NC组相比，从48 h开始si-MUC1组、Propofol组和si-MUC1+Propofol组H460细胞吸光度值明显降低（

P

＜0.05），与si-MUC1组和Propofol组相比，从48 h开始si-MUC1+Propofol组H460细胞吸光度值显著降低（

P

＜0.05）。提示敲低MUC1和丙泊酚均能抑制H460细胞增殖，两者联合对H460细胞增殖抑制作用更强。

表1 各处理组H460细胞在24、48和72 h时吸光度值比较/（A，±s）

2.4 MUC1 siRNA联合丙泊酚对H460细胞克隆形成能力的影响

si-NC组、si-MUC1组、Propofol组和si-MUC1+Propofol组细胞克隆形成数分别为：（163.36±8.22）个、（101.26±7.69）个、（92.64±6.88）个、（52.09±6.14）个。提示敲低MUC1和丙泊酚均能抑制H460细胞克隆形成能力，两者联合对H460细胞克隆形成能力的抑制作用更显著。见图2。

图2 克隆形成实验检测各组肺癌H460细胞克隆形成能力：A为si-NC组；B为si-MUC1组；C为Propofol组；D为si-MUC1+Propofol组

2.5 MUC1 siRNA联合丙泊酚对H460细胞中蛋白表达的影响

Western blotting检测结果如图3和表2所示，提示敲低MUC1和丙泊酚均能下调H460细胞中PCNA、cyclin D1和p-Akt蛋白表达，两者联合对H460细胞中PCNA、cyclin D1和p-Akt蛋白表达下调作用更明显。

图3 Western blotting检测各组肺癌H460细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白水平

3 讨论

肺癌具有发病率高、死亡率高、复发率高等特点，是全球最常见的肿瘤之一。目前治疗肺癌的策略主要包括手术切除，以化疗和放疗进行辅助的综合治疗方式，然而往往不能达到预期治疗效果。因此，探索更合理、高效的联合治疗手段对肺癌的临床治疗具有十分重要的意义。报道显示，黏蛋白（Mucin，MUC）家族中多个成员与肿瘤的发生、发展、转移及预后相关。MUC1作为MUC家族重要成员，在细胞增殖、分化、周期进程、侵袭和迁移中发挥重要作用。研究已证实MUC1在多种类型癌症中表达上调，如段海章等报道指出，MUC1在胆囊癌组织中呈高表达，且MUC1的表达量与胆囊癌的浸润程度和恶性程度呈正相关，可作为胆囊癌的肿瘤标志物。Ma等研究显示，LincRNAROR/miR-145在三阴性乳腺癌细胞系中的侵袭和转移中的作用是通过靶向调控MUC1的表达来影响E-钙黏蛋白膜定位实现的。有学者提出LINC01296/miR-26a/GALNT3轴通过PI3K/AKT信号转导途径调节O-糖基化MUC1促进结直肠癌的进展。近期研究发现，肺癌中MUC1的高表达水平与早期复发、预后不良和高转移潜能密切相关，且MUC1敲低能够抑制肺癌的生长和转移。本研究结果表明转染MUC1 siRNA能够有效敲低H1650细胞中MUC1基因表达。CCK-8和克隆形成实验结果观察到MUC1敲低能够抑制肺癌H1650细胞生长，这与先前的研究一致。

丙泊酚是临床上手术常用的麻醉药，其在肿瘤复发中的研究已得到国内外研究者的广泛关注。研究显示，丙泊酚在肺癌中能够降低术后肿瘤复发，且可抑制肺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。但目前关于MUC1 siRNA联合丙泊酚是否协同抑制肺癌的研究仍未报道。本研究结果显示，不同浓度的丙泊酚对H460细胞活力有不同程度的抑制作用，单独敲低MUC1或丙泊酚处理均能抑制H460细胞生长；且敲低MUC1联合丙泊酚对H460细胞生长抑制作用更显著。此外该结论由PCNA和cyclin D1蛋白表达降低进一步证实。PCNA是细胞处于增殖状态的良好分子标志物，目前已广泛应用于肿瘤细胞。cyclin D1属于高度保守的细胞周期家族成员之一，其主要功能是促进细胞增殖。本实验Western blotting检测各处理组H460细胞中PCNA和cyclin D1发现，敲低MUC1或丙泊酚均能够下调PCNA和cyclin D1的表达，且两者联合对PCNA和cyclin D1表达抑制作用更强。Akt信号通路在多种肿瘤中异常激活，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学过程。本研究结果显示，敲低MUC1或丙泊酚均能够下调p-Akt的表达，两者联合对p-Akt下调作用更明显，提示敲低MUC1或丙泊酚均可抑制Akt信号通路的激活，两者联合对Akt信号通路抑制作用更显著。

表2 各组肺癌H460细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达水平比较/±s

综上，敲低MUC1基因表达和丙泊酚均能通过抑制Akt信号通路的激活抑制肺癌H460细胞生长，且两者联合对H460细胞生长抑制作用更强。本实验结果提示基因治疗联合药物使用在阻碍肺癌发展中可能发挥较好作用，但其适用性尚需进一步深入探究。