异丙酚抑制内质网应激减轻脂多糖诱导人肝细胞损伤的机制研究
2021-03-24宋云飞
肝脏是一种新陈代谢器官，不断向机体提供营养，并消除体内废物和有毒有害物质。肝脏也是一个具有复杂免疫活性的部位，可产生具有调节免疫功能的细胞因子，清除侵入者使机体内环境恢复平衡。然而，不能被消除的入侵者或未被控制的炎症反应会导致肝脏的慢性感染，出现肝纤维化、肝细胞功能障碍和脂肪变性等病理性改变。许多研究表明，内毒素中的脂多糖（LPS）成分可通过多种有害途径引起肝细胞损伤。随着对内毒素研究的加深，如何发掘保肝药物，缓解肝细胞损伤显得尤为重要。
异丙酚是临床上用于静脉全麻常用药物之一，具有醒脑快、持续输注、无蓄积等优点。近年来，研究发现异丙酚对肾脏、肝脏等器官具有较好的保护作用。Wei等报道异丙酚对肝缺血再灌注损伤的保护作用。然而，异丙酚是否对LPS所致肝损伤有保护作用尚不清楚。所以本实验用20 mg/L的LPS诱导L-02细胞损伤，观测不同剂量异丙酚（PPF）对其保护作用，为临床上治疗感染性休克提供一定的基础理论和依据。
1 材料与方法
1.1 试剂
异丙酚（货号D126608）购自Sigma公司；LPS购自Sigma公司，用灭菌水配成2g/L母液备用；RPMI Medium 1640培养基和胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；青-链霉素（penicillin-strepotomycin，P/S）购自Thermo公司；MTT、人丙氨酸氨基转移酶（ALT）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、人天冬氨酸氨基转移酶（AST）ELISA试剂盒购自酶免公司；白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNFα）引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Hieff™qPCR SYBR® Green Master Mix购自上海翊圣生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）购自碧云天生物技术研究所；兔抗核因子-κB（NF-κB）p65、NF-κB、p-肌醇依赖酶1α（IRE1α）、IRE1α、激活转录因子6（ATF-6）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗购自Cell Signaling Technology公司，HRP标记二抗购自Santa Cruz Biotechnology公司。1.2 仪器
倒置荧光显微镜（德国徕卡）；DFC500照相系统（德国莱卡）；多功能酶标仪（南京德铁）；二氧化碳培养箱（Thermo公司）；超低温冰箱（青岛海尔）；蛋白质印迹法（Western blotting）电泳仪和转膜仪（Bio-Rad）。1.3 L
-02细胞的培养
将L-02细胞（人正常肝细胞系，辽宁中医药大学药学院馈赠）培养于含有10% FBS和1% P/S的RPMI 1640培养基中，含有5%二氧化碳-95%空气的37℃的培养箱中进行培养，取生长期的细胞以5×10/mL的密度接种于经多聚赖氨酸包被的96孔板中，每孔100µL。1.4 LPS诱导L
-02细胞损伤模型的制备
将细胞按随机数字表法分为0（正常组）、5、10、15、20、25 mg/L的LPS组，每组6个复孔，待细胞长到80%以上时，加入不同浓度的LPS，置于含有5%二氧化碳-95%空气的37℃的培养箱中进行培养6、12、24、48 h，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测各组细胞的存活情况，确定损伤模型。1.5 PPF给药处理及分组
将细胞分为正常组、LPS模型组（LPS）、LPS+25和50µmol/L PPF给药组以及LPS+4 mmol/L 4-苯基丁酸（PBA）的阳性药组，每组6个复孔，观察PPF对LPS致肝细胞损伤的保护情况。1.6 MTT法检测细胞存活能力
收集经过处理的接种于96孔培养板中各组细胞的培养基后，每孔加入终浓度为0.5 g/L的MTT溶液，置于含有5%二氧化碳-95%空气的37℃的培养箱中培养。4 h后弃掉培养液，加入150µL二甲基亚砜（DMSO）溶液在摇床上慢摇直至蓝紫色甲瓒完全溶解，然后用多功能酶标仪在492 nm处测定各组细胞的吸光度。1.7 ELISA法检测细胞上清中ALT和AST含量
按照ELISA试剂盒说明书所示方法检测上步收集的各组细胞上清液中ALT和AST的表达，根据标准曲线计算各组的ALT和AST的蛋白浓度。1.8 qRT
-PCR检测各组细胞中IL
-1
β、IL
-6和TNF
-αmRNA水平
按Trizol法取各组细胞的总RNA，按照Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit所示步骤将RNA反转成cDNA。根据Hieff™qPCR SYBR® Green Master Mix（Low Rox Plus）所示比例构建qPCR反应。反应条件：95℃预变性0.5 min，95℃变性5 s，55℃退火0.5 min，共持续40个循环，引物序列如表1。IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA在各组细胞中的相对表达水平结果用2表示。1.9 Western blotting检测各组细胞中NF
-κB p65、NF
-κB、p
-IRE1
α、IRE1
α和ATF
-6蛋白水平
取培养于培养瓶中的各组细胞，分别加入各种蛋白酶抑制剂，用细胞刮刮下细胞收集起来；4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清于1.5 mL离心管中等待定量。采用BCA法测定蛋白浓度后，各组取30µg蛋白煮沸变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳，320 mA恒流转膜1.5 h，5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，按1∶1 000比例加入NF-κB p65、NF-κB、p-IRE1α、IRE1α、ATF-6和GAPDH抗体稀释液，TBST洗膜3次，每次5 min，1∶1 000比例加入HRP标记二抗，室温孵育1 h。ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统成像，Image J软件计算灰度值，采用目的条带与内参蛋白条带光密度比值作为结果进行统计分析。
表1 PCR相关序列
2 结果
2.1 不同浓度LPS对人肝细胞存活能力的影响
由图1可知，在LPS处理0 h时，通过MTT法检测各组人正常肝细胞的存活能力，发现各组细胞存活能力与正常组（0 mg/L LPS）之间差异无统计学意义（P
＞0.05），说明各组细胞在处理前状态一致，保证实验准确性；而LPS对肝细胞活力的影响具有剂量以及时间依赖性（见图1），LPS作用24 h在浓度范围内接近线性变化并且剂量为20 mg/L的细胞（存活率为50.74%）处于亚健康状态，因此选择20 mg/L LPS作用24 h作为致肝损伤模型剂量。
图1 MTT法比较不同浓度LPS对各组肝细胞的存活率影响
2.2 PPF改善损伤肝细胞的形态
如图2所示，正常组肝细胞贴壁较好，结构完整，折光性较强，细胞形态比较清晰；LPS组细胞胞体大部分皱缩成圆球状，贴壁性不好容易脱落，镜下可见部分细胞漂浮于培养基中；而给予低高浓度的PPF组和PBA阳性药组细胞状态较LPS组有所改善，贴壁较好，细胞胞体大都成纺锤体或梭形，数目明显增多。2.3 PPF提高损伤肝细胞的存活能力
与正常组（100±9.30）%相比，LPS组肝细胞存活率显著降低为（54.26±7.77）%（P
＜0.01）；而给予低高浓度的PPF和PBA的细胞存活能力显著上升［LPS+25µmol/L PPF：（66.86±4.31）%，LPS+50µmol/L PPF：（84.71±7.30）%，LPS+4 mmol/L PBA：（83.74±7.48）%］（P
＜0.05），F
=34.125，P
＜0.001。2.4 PPF降低损伤肝细胞中AST和ALT的含量
表2 结果显示，LPS组细胞上清液中AST和ALT浓度与正常组相比，差异有统计学意义（P
＜0.01）；在孵育了低高浓度PPF和PBA后的细胞上清液中AST和ALT浓度显著降低，与LPS组相比差异有统计学意义（P
＜0.01）。2.5 PPF降低损伤肝细胞中IL
-1
β、IL
-6和TNF
-αmRNA的表达
如表3所示，与正常组比较，LPS组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达明显上升（P
＜0.01）；与LPS组相比，给予低高浓度PPF组和PBA组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达降低（P
＜0.01）。2.6 PPF降低损伤肝细胞中NF
-κB蛋白的磷酸化
如图3所示，LPS组NF-κB p65蛋白水平较正常组相比显著性升高［（3.16±0.42）比（1.00±0.16），P
＜0.01］；而给予了低高浓度PPF组和PBA组的细胞中NF-κB p65蛋白水平明显降低至（2.50±0.38），（1.81±0.20）和（1.84±0.17）（P
＜0.01），且不同组间均数比较，F
=47.267，P
＜0.001。
图2 光镜下各组人肝细胞的形态（×100）
表2 各组L-02细胞中ALT和AST浓度/（mg/L，±s）
表3 各组细胞中相关炎性因子的mRNA表达/±s
图3 比较各组L-02细胞中核因子-κB（NF-κB）磷酸化蛋白水平的表达
2.7 PPF降低损伤肝细胞中ATF
-6和p
-IRE1
α蛋白的表达
表4和图4结果显示，与正常组相比，LPS组ATF-6和p-IRE1α表达量明显增加（P
＜0.01）；低高浓度PPF和PBA组能降低ATF-6和p-IRE1α的表达，差异有统计学意义（P
＜0.01）。3 讨论
机体发生严重感染，尤其是革兰阴性菌感染时极易引起感染性休克。机体中的致病微生物及其毒产物等进入血液循环系统后，首先激活宿主的免疫细胞，释放各种细胞因子，随后损伤机体重要器官如肝脏，导致肝细胞缺血缺氧、代谢紊乱、功能障碍，甚至肝功能衰竭。LPS是存在于革兰阴性菌细胞壁中的主要成分之一，当细菌裂解或死亡时，LPS才会从细胞中释放出来，发挥对宿主的毒性作用。内毒素血症是肝功能衰竭发生的外源性物质基础，我们选用LPS诱导L-02人正常肝细胞损伤，体外模拟感染性休克对肝细胞的损伤。结果表明，LPS会导致L-02人正常肝细胞形态变差，核固缩，存活能力明显下降；而给予不同浓度的PPF对LPS致人肝细胞形态有一定的改善作用；显著提高损伤肝细胞的存活能力，且呈浓度依赖性，说明PPF对受损的肝细胞具有保护作用。ALT和AST是临床上最常用的肝功能检测指标之一，有研究表明，肝细胞损伤时，ALT和AST表达明显升高，其表达水平与肝细胞受损的程度呈正相关。为了确定PPF是否对受损的肝细胞具有保护作用，我们采用ELISA试剂盒检测各组细胞培养液中AST和ALT的浓度。研究结果发现LPS组肝细胞中ALT和AST表达显著升高，说明模型的成功建立；而给予不同浓度的PPF后降低了ALT和AST的含量。
表4 各组细胞中ATF-6和p-IRE1α蛋白的表达/±s
图4 蛋白质印迹法检测各组L-02细胞内质网应激相关蛋白的表达
越来越多的证据表明，肝脏调节免疫反应与内质网应激和炎症有关。诱发炎症的病原体相关分子和损伤相关分子会激活所谓的“急性期反应”，主要是由IL-6、转录激活因子3、促炎细胞因子IL-1β和肿瘤坏死因子α（TNF-α）介导的早期全身反应。急性期反应的靶点肝细胞通过产生急性期蛋白，使代谢和分泌蛋白的储备适应变化的需求。急性期蛋白可迅速诱发机体产生以防御为主的非特异性反应，清除入侵机体的病原体或损伤的组织，同时激活抗炎和肝脏免疫调节机制。但是，未能被清除的病原体或损伤的组织及炎症进一步发展，则可导致肝脏慢性感染、自身免疫反应及恶性肿瘤的发生。本实验结果发现与正常组相比，LPS组人肝细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表达显著升高。说明LPS可能通过炎性因子释放来损伤肝细胞，而给予不同剂量的PPF后的人肝细胞与LPS组相比，IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平的表达显著降低。说明PPF可以通过抑制炎性因子的释放来发挥对受损肝细胞的保护作用。
有证据表明内质网应激与炎症反应的诱导直接相关。内质网（ER）是蛋白质折叠修饰组装以及细胞内钙贮存的场所，约1/3新合成的蛋白被转运到ER内并折叠成正确的三维结构，然后运输到达目的地。当蛋白发生不正确的加工或修饰时，将会引起ER平衡失调，从而导致ER应激。早期的ER应激通过激活非折叠蛋白反应（UPR）减轻ER内压力，而长期严重的ER应激则导致细胞凋亡或死亡。NF-κB是一类转录因子蛋白家族，参与多种炎症基因的转录调控，在炎症反应中发挥重要作用。静息状态下，NF-κB与NF-κB抑制蛋白（IκB）形成复合物，以无活性形式存在于胞质中。当细胞受多种外界因素（包括应激性损伤细菌脂多糖病毒氧自由基和细胞因子）刺激后，IκB激酶复合物（IKK）被激活并磷酸化IκB，使NF-κB游离并暴露核定位位点，游离的NF-κB迅速移位到细胞核，与NF-κB反应基因启动子区域的特异性序列结合，参与炎症反应基因的转录调控。目前研究发现UPR的3条信号通路，即PERK、IRE1α和ATF-6均能激活NF-κB。本研究发现LPS组细胞NF-κB p65、p-IRE1α/IRE1α和ATF-6的表达较正常组明显升高，低高剂量PPF治疗后NF-κB p65、p-IRE1α/IRE1α和ATF-6增强的作用被抑制。为了进一步证实PPF对LPS损伤的肝细胞的治疗效果，我们采用了ER-stress的抑制剂PBA作为阳性对照，结果发现高剂量PPF与PBA的治疗效果相当。
综上所述，PPF有助于缓解LPS诱导的人肝细胞损害反应，抑制炎性因子的释放，发挥肝保护作用。其机制可能与PPF减轻内质网应激，抑制炎症通路NF-κB的活化，维持体内细胞所处的微环境稳定有关，但具体的作用机制尚需进一步研究。
