白细胞介素-18抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡的机制研究

肝癌是临床常见消化系统恶性肿瘤，其病死率及患病率极高，以肿瘤细胞高度转移性及侵袭性为主要病理基础特征，由于肝癌发病较隐匿导致病人确诊时已处于肝癌晚期导致手术治疗效果差。因而探讨肝癌细胞增殖及凋亡的机制对肝癌分子诊断及靶向治疗均具有重要意义。白细胞介素-18（IL-18）主要是由单核巨噬细胞等产生且具有多种生物活性，研究表明IL-18可通过促进NK细胞等产生炎性因子进而参与感染、肿瘤等多种生理病理过程。相关研究发现IL-18可通过调控肿瘤细胞增殖及迁移进而抑制肿瘤发生及发展过程。研究表明IL-18在肝癌组织及细胞株中不表达或少量表达，并与肝细胞肝癌的发生密切相关。IL-18能够通过启动经典的凋亡途径诱导舌鳞癌细胞凋亡。然而，关于IL-18在肝癌发生及发展过程中的作用机制尚未可知。柴红涛等研究表明Wnt/β-连环素（β-catenin）信号通路活化可促进肝癌等多种恶性肿瘤发生及发展。研究表明维生素K2可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的增殖及侵袭能力，诱导细胞凋亡。IL-18是否可通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响肝癌细胞生物学行为尚未可知。本研究于2018年10月至2019年9月通过构建IL-18过表达载体观察IL-18表达变化对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其与Wnt/β-catenin信号通路的作用关系，为临床诊断及治疗肝癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肝癌细胞株HepG2、Bel-7402购自美国典型培养物保藏中心；正常肝细胞株L02购自中国典型培养物保藏中心。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测试剂盒购自美国Promega公司；膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙锭（PI）细胞凋亡试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；pcDNA3.1载体与脂质体Lipofectamine2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；IL-18、Bax、Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1一抗均购自美国Cell Signaling Technology公司；HRP标记的二抗购自北京中桥金衫生物公司；二甲基亚砜（DMSO）购自北京普博欣生物科技有限责任公司；Trizol、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；Wnt/β-catenin通路激活剂（SKL2001）购自美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养、转染及分组 用含有10% FBS的RPMI 1640培养液培养HepG2、Bel-7402、L02细胞，放入37℃、二氧化碳体积分数5%恒温培养箱内培养，胰蛋白酶消化细胞，细胞融合度达到80%时进行传代培养。收集对数生长期HepG2细胞接种于6孔板，转染前1 d更换不含胎牛血清RPMI 1640培养液，构建真核表达质粒pcDNA3.1-IL-18（扩增IL-18基因序列，扩增区为IL-183"非翻译区（UTR）的5"端63 bp至3"端871 bp，IL-18基因克隆到T-Vector，测序验证，用XbaⅠ与BamHⅠ双酶切连接至XbaⅠ与BamHⅠ双酶切的pcDNA3.1（+）得到pcDNA3.1-IL-18），分别将空载体（pcDNA3.1）与pcDNA3.1-IL-18转染至HepG2细胞，分别为pcDNA组、pcDNA-IL-18组。为了验证IL-18是否通过抑制Wnt/β-catenin通路发挥作用，因此本研究在pcDNA-IL-18组HepG2细胞中加入浓度为20µmol/L的SKL2001（pcDNA-IL-18+SKL2001组）。每组均设置5个复孔。同时将正常培养的HepG2细胞作为Blank组。

1.2.2

qRT-PCR检测细胞中IL-18、Bax、Bcl-2mRNA表达水平 按照Trizol法提取细胞总RNA，测定RNA浓度与纯度，取1µg RNA为模板按照逆转录试剂盒将RNA逆转录为互补DNA（cDNA），反应条件：37℃15 min，85℃30 s。IL-18引物由上海生物工程股份有限公司合成，采用qRT-PCR检测试剂盒，IL-18正向引物为5"-CGTTGTCACAGATAAAGAGCCAG-3"，反向引物为5"-TGACCAGGAGAGTGTACGACG-3"；Bax正向引物为5"-TTTCTGACGGCAACTTCAACTG-3"，反向引物为5"-CAACCACCCTGGTCTTGGAT-3"；Bcl-2正向引物为5"-CGCAGAGGGGCTACGAGT-3"，反向引物为5"-GTTGACGCTCTCCACACACAT-3"。按照说明书配反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10µL，cDNA 2µL，上反向引物各0.8µL，ROX Reference Dye（50×）0.4µL，双蒸水（ddHO）6µL以此检测IL-18、Bax、Bcl-2 mRNA的表达；反应条件：95℃5 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共30个循环，IL-18、Bax、Bcl-2均以GAPDH为内参，使用ABI 7500荧光定量PCR仪分析软件对实验数据进行分析，以2法计算IL-18、Bax、Bcl-2的相对表达量。

1.2.3

蛋白质印迹法（Western blotting）检测IL-18、Bax、Bcl-2、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达 预冷磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤细胞后分别加入RIPA蛋白裂解液（400µL），裂解时间为30 min，4℃条件下经离心机离心30 min，提取细胞总蛋白，配置SDSPAGE凝胶，分别取蛋白样品与上样缓冲液混合液上样，电泳反应条件依次为80 V 30 min，120 V 90 min，根据marker位置切胶并应用湿转膜仪将蛋白凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），依次加入5%脱脂奶粉、1×TBS、吐温-20（0.1%）室温条件下封闭3 h，分别加入IL-18（1∶400）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、β-catenin（1∶500）、Cyclin D1（1∶500）一抗，TBST洗膜，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光显影，置于凝胶成像分析系统及应用Quantityone软件分析各蛋白条带灰度值。

1.2.4

MTT检测细胞增殖 收集各组对数生长期HepG2细胞，胰蛋白酶消化后以每孔100µL体积接种至96孔板（浓度为3×10/L），在37℃、二氧化碳体积分数5%、相对湿度95%的培养箱内培养24 h、48 h、72 h，分别加入MTT试剂（20微升/孔），继续培养4 h，弃上清，每孔分别加入150µL DMSO，摇床振荡10 min后应用酶标仪于490 nm波长处检测各孔相对吸光度。

1.2.5

Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡 收集各组对数生长期HepG2细胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞并调整细胞密度为1×10/L，PBS清洗，弃上清，分别加入预冷的100µL结合缓冲液悬浮细胞，依次加入10µL Annexin V-FITC与10µL PI，混匀后避光孵育15 min，应用CytoFLEX流式细胞仪检测各组HepG2细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 IL

-

18在肝癌HepG2、Bel

-

7402细胞和正常肝细胞L02中的表达

由图1、表1可知，与正常肝细胞L02相比，肝癌HepG2、Bel-7402细胞中IL-18 mRNA及蛋白表达均显著降低（

P

＜0.05）。HepG2细胞中IL-18 mRNA及蛋白表达水平相对较低，因此本研究选取HepG2细胞进行后续研究。

图1 正常肝细胞L02和肝癌HepG2、Bel-7402细胞IL-18蛋白免疫印迹图

表1 白细胞介素-18（IL-18）在肝癌HepG2、Bel-7402细胞和正常肝细胞L02中的表达/±s

2.2 过表达IL

-

18对肝癌HepG2细胞增殖的影响

HepG2细胞中转染IL-18过表达载体（pcDNAIL-18），Western blotting检测结果发现IL-18蛋白表达明显升高（

P

＜0.05），表明成功提高HepG2细胞中IL-18表达。MTT实验结果显示，相较于pcDNA组，培养48 h、72 h时pcDNA-IL-18组HepG2细胞吸光度值均显著降低（

P

＜0.05），见图2、表2。表明IL-18过表达可抑制HepG2细胞增殖。

图2 各组肝细胞IL-18蛋白免疫印迹图

表2 过表达白细胞介素-18（IL-18）对肝癌HepG2细胞增殖的影响/±s

2.3 过表达IL

-

18对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡情况，Blank组、pcDNA组、pcDNA-IL-18组HepG2细胞凋亡率分别为（5.87±0.19）%、（6.93±0.22）%、（20.54±3.97）%（

F

=190.070，

P

＜0.001），pcDNA-IL-18组HepG2细胞凋亡率显著高于pcDNA组（

P

＜0.05），见图3。

2.4 过表达IL

-

18对肝癌HepG2细胞凋亡相关基因表达的影响

为明确IL-18是否通过调控线粒体凋亡途径进而促进肝癌HepG2细胞凋亡，采用qRTPCR与Western blotting分别检测HepG2细胞中促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA及蛋白表达，结果显示pcDNA-IL-18组HepG2细胞Bax mRNA及蛋白表达均显著高于pcDNA组（

P

＜0.05），而Bcl-2 mRNA及蛋白表达均显著降低（

P

＜0.05），见图4、表3。表明IL-18可通过上调Bax表达及下调Bcl-2表达进而激活线粒体凋亡途径促进细胞凋亡。

2.5 过表达IL

-

18对肝癌HepG2细胞Wnt/

β

catenin通路的影响

用Western blotting检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、Cyclin D1表达，结果发现pcDNA-IL-18组HepG2细胞β-catenin、Cyclin D1蛋白表达均显著低于pcDNA组（

P

＜0.05），见图5、表4。表明IL-18可能通过抑制Wnt/β-catenin通路进而参与肝癌发生及发展过程。

图4 各组肝细胞Bax、Bcl-2蛋白免疫印迹图

表3 过表达白细胞介素-18（IL-18）对肝癌HepG2细胞凋亡相关基因表达的影响/±s

图5 各组肝细胞β-catenin、Cyclin D1蛋白免疫印迹图

表4 过表达白细胞介素-18（IL-18）对肝癌HepG2细胞Wnt/β-catenin通路的影响/±s

2.6 Wnt/

β-

catenin通路激活剂（SKL2001）逆转了过表达IL

-

18对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用

为了验证IL-18是否通过抑制Wnt/β-catenin通路而发挥作用，在HepG2细胞中转染pcDNA-IL-18 12h后加入Wnt/β-catenin通路激活剂（SKL2001），结果显示，IL-18过表达后细胞吸光度明显降低（

P

＜0.05），而细胞凋亡率明显升高（

P

＜0.05），但加入SKL2001激活剂后，与pcDNA-IL-18组相比，pcDNAIL-18+SKL2001组HepG2细胞吸光度明显增加（

P

＜0.05），而细胞凋亡率显著降低（

P

＜0.05），见表5。表明IL-18可通过抑制Wnt/β-catenin通路进而抑制HepG2细胞增殖，促进细胞凋亡。

表5 SKL2001逆转了过表达白细胞介素-18（IL-18）对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用/±s

3 讨论

肝癌早期诊断及治疗手段均逐步提高但治疗效果不佳，因而积极预防与寻找有效治疗方法成为重点问题。肝癌细胞增殖与凋亡失衡是促进该疾病发生及发展的重要原因，通过抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡是干预癌症进展的有效手段。研究表明Th1、Th2等免疫微环境细胞因子表达异常可参与多种肿瘤发生及发展过程。因此积极探究与肝癌发生密切相关的细胞因子对肝癌精准治疗及提高病人生存率均具有重要意义。

IL-18主要作用于NK细胞、B细胞及T细胞，研究显示IL-18在卵巢癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞中均呈低表达，上调IL-18表达可抑制肿瘤发生及发展，进一步探究其可能作用机制为IL-18可通过调节Th1/Th2细胞分化过程并促进由Fas-FasL介导的细胞凋亡过程进而导致肿瘤细胞凋亡。但不少研究显示IL-18可通过促进肿瘤新生血管生成进而促进肿瘤发生及发展。然而，IL-18在肝癌发生及发展过程中的作用尚未完全阐明。本研究结果显示肝癌HepG2、Bel-7402细胞中IL-18均呈低表达，预实验结果中IL-18在肝癌HepG2细胞中的表达相对较低，因此在HepG2细胞中转染IL-18过表达质粒，初步分析IL-18过表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响，结果显示IL-18过表达后HepG2细胞增殖活性明显降低，而细胞凋亡率明显升高，进一步分析细胞凋亡相关蛋白表达结果发现IL-18过表达后HepG2细胞Bax表达上调，而Bcl-2表达下调，细胞凋亡受Bax、Bcl-2蛋白调控，Bcl-2/Bax与Bcl-2/Bcl-x1形成二聚体时可抑制细胞凋亡，而Bax自身形成二聚体时可通过激活线粒体凋亡途径进而促进细胞凋亡。提示IL-18过表达可通过激活线粒体凋亡途径进而促进肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。

Wnt/β-catenin信号通路可调节细胞增殖及黏附等多种细胞生物学行为，研究显示Wnt/β-catenin信号通路可促进乳腺癌、肝癌及结直肠癌等多种恶性肿瘤发生及发展过程。Wnt蛋白可激活GSK-3β发生磷酸化进而促使β-catenin转移至细胞核，并可激活下游靶基因Cyclin D1等靶基因进而增强细胞增殖及迁移能力。研究表明肿瘤细胞中β-catenin蛋白表达量升高可促进肿瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡，其表达水平越高预示肿瘤恶性程度越高。研究表明通过抑制Wnt/β-catenin信号通路可抑制肝癌细胞增殖。由此猜测IL-18是否可通过调控Wnt/βcatenin信号通路进而参与肝癌发生及发展过程，本研究结果显示IL-18过表达后HepG2细胞Wnt/βcatenin信号通路相关蛋白β-catenin及其下游靶基因Cyclin D1的表达水平均显著降低，说明IL-18过表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路活化。提示IL-18可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路进而影响肝癌发生及发展过程。同时本研究进一步验证IL-18通过调控Wnt/β-catenin信号通路对肝癌细胞增殖及凋亡的影响，结果显示IL-18过表达后加入Wnt/βcatenin信号通路激动剂可明显逆转IL-18过表达对肝癌细胞增殖的抑制及细胞凋亡的促进作用。提示IL-18可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路中βcatenin表达并下调下游蛋白Cyclin D1进而促进肝癌细胞凋亡并抑制细胞增殖。

综上所述，IL-18在肝癌细胞中呈低表达，上调IL-18表达可通过激活线粒体凋亡途径与抑制Wnt/β-catenin信号通路激活进而抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。然而，肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的机制尚未完全阐明，关于肝癌迁移及侵袭的分子机制仍有待研究。