肺癌线粒体DNA诱导小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3恶性转化的研究

细胞核内的遗传物质，它在肿瘤的形成和发展过程中起着重要的作用。核外的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是在具有DNA基因组的细胞中存在的唯一的核外遗传物质。这种遗传物质具有DNA基因组，能够自主复制。因线粒体内氧浓度较高，长期暴露于这种高浓度氧环境下的mtDNA容易发生突变。其中mtDNA的1 120 bp（16025-576）组成的D环区是突变的热点所在，其在肿瘤发生发展中的作用正备受关注，在胃癌、肠癌、鼻咽癌等实体恶性肿瘤中，已见到针对该区域相关突变位点的相关报道，但这些报道均未涉及mtDNA在恶性肿瘤发生和演变中的作用和机制。本研究于2017年1月至2019年6月将肺癌细胞突变mtDNA片段转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3，观察mtDNA片段在成纤维细胞核内的整合情况，并观察转染细胞的生物学行为变化，以探讨变异的mtDNA在肿瘤发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3及肺癌细胞A549、H226购于上海福祥生物科技有限公司。G480、脂质体转染Lipofection2000转染试剂均购自英韦创津（Invintrogen）公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶购自Gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），二甲基亚砜（DMSO）、姬姆素染料（Giemsa stain）购自Sigma-Aldrich公司。本课题组将突变的肺癌细胞mtDNA的D环区插入到pcDNA3.1（+）载体BamH I，构建了XhoⅠ位点间的重组表达载体。分别命名为pcDNA3.1（+）-A549 mtDNA、pcDNA3.1（+）-H226 mtDNA；mtDNA提取试剂盒购自杭州维特洁（V-gene）生物技术公司；荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）试剂盒购于天津灏洋生物科技公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）是从上海碧云天生物科技有限公司购得的。流式细胞仪购自Epics Elite，Coulter Corporation，U.S.A。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养 将NIH3T3、A549及H226细胞在含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养基中传代培养，待生长至对数生长期时，用适当量的9 g/L胰蛋白酶消化后，培养贴壁生长良好的细胞。

1.2.2

细胞转染与筛选 将胰蛋白酶消化传代培养处于对数生长期的NIH3T3细胞，先以计数板计数细胞浓度后，细胞浓度进一步调整到大约1×10个/毫升，将2 mL的细胞悬液接种于6孔板。用脂质体转染法将重组载体（pcDNA3.1（+）-A549 mtDNA、pcDNA3.1（+）-H226 mtDNA）转染NIH3T3细胞，具体转染操作过程参考英伟创津（Invintrogen）公司的Lipofection2000说明书。将转染了重组载体的6孔板，置入二氧化碳饱和湿度的培养箱中培养24 h后，以遗传霉素418（Geneticin418，G418）行抗性筛选。将转染了重组载体的NIH3T3分别命名为NIH3T3/A549-mtDNA、NIH3T3/H226-mtDNA。

1.2.3

NIH3T3细胞染色体核型分析 将不同组别的细胞分别加入25 mg/L秋水仙素2 h，终止细胞分裂，收集细胞；加入37℃预热的0.075 mol/L 8 mL的氯化钾溶液20 min，加入新鲜配制的固定液，2 000 r/min离心5 min，弃上清，重复两次；细胞悬液滴在预冷的湿片上，烤干，9 g/L胰蛋白酶，不添加乙二胺四乙酸（EDTA）EDTA，2%的Gimsa染色5 min后，油镜下观察染色体。

1.2.4

FISH mtDNA探针由天津灏洋生物制品科技有限公司设计，通过PCR法合成。探针3"端标记地高辛，5"端标记荧光素。探针1：A aactccaccattagcaccc；A"ggtggctggcagtaatgta，产物大小144；探针2：B ctgccagccaccatgaatat；B"gggacgagaagggatttg，产物大小262。将探针稀释成终浓度为5 mg/L，当在75℃恒温水浴中孵育5 min，并立即放置在0℃5 min以变性mtDNA探针，用70%甲酰胺/2×柠檬酸钠缓冲液（SSC）在75℃下变性2～3 min。将样品用70%、90%和100%的冰乙醇梯度脱水5 min，然后干燥空气。标本加100µL含变性的mtDNA探针的杂交液［杂交液里含50%去离子甲酰胺、5×SSC、10%硫酸葡聚糖、5×Denhardt液、2%十二烷基磺酸钠（SDS）100µg/mL，硅精鱼DNA］，42℃杂交过夜。用50%甲酰胺/2×SSC洗涤3次，5分钟/次，1×SSC洗涤3次，5分钟/次，室温干燥玻片。滴加抗地高辛荧光抗体免疫球蛋白G（IgG）液（0.2 g/L）与小牛血清（终浓度为5%）的混合液，37℃避光温育20 min以放大信号，经封片，在激光显微镜下观察染色体间期细胞核上的黄绿色荧光。

1.2.5

四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）测定细胞增殖 以每孔1.5×10的单细胞悬液种植于96孔板，加入200µL的DMEM PRMI-1640高糖培养基，每组设3个复孔，在不同的时间点，添加MTT溶液30µL，继续培养4 h，并丢弃上清液，加入DMSO 200µL，30 min后在570 nm波长下，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测定孔光的吸收值，并记录结果。实验重复3次，记录不同组细胞0 h、24 h、48 h、72 h 570 nm所测吸光度的数据。

1.2.6

流式细胞仪检测细胞凋亡 弃培养基，细胞与1µL与Annexin V-FITC混合2 min后，加入5µL碘化丙啶。细胞在室温下培养5 min。流式细胞仪检测细胞凋亡。

2 结果

2.1 转染前较转染后NIH3T3细胞染色体核型分析

NIH3T3是小鼠胚胎成纤维细胞，正常小鼠染色体数目为40条，20对（包括性染色体）。图1示：NIH3T3/A549-mtDNA、NIH3T3/H226-mtDNA的染色体出现了易位（箭头1所示）、断裂（箭头2所示）的染色体结构畸形。结果表明，转染肺癌细胞mtDNA的NIH3T3细胞具有恶性转化的趋势。不同视野下畸变的多倍体数目和染色体数目占全部染色体数目百分比具体见表1。

图1 转染前后小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3染色体核型（×1 000）：A为NIH3T3/A549-线粒体DNA（mtDNA）的核型；B为NIH3T3/H226-mtDNA的核型；C为NIH3T3的核型

表1 不同视野小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的畸形的多倍体数目和染色体数目占全部染色体数目百分比/（%，±s）

2.2 荧光原位杂交结果

MtDNA探针是一种分离重排探针，针对处于有丝分裂间期细胞核，此期细胞核因未进行有丝分裂而处于无丝状结构的状态，根据碱基互补配对原则，有荧光物质的探针与目标DNA结合后，融合成黄色的阳性杂交信号。本实验中，通过荧光显微镜观察到2条mtDNA探针在NIH3T3/A549-mtDNA、NIH3T3/H226-mtDNA的细胞染色体间期核中均出现黄色的阳性杂交信号；在未转染重组载体的NIH3T3细胞染色体间期核中无阳性杂交信号。说明突变的mtDNA能够整合在处于有丝分裂间期的NIH3T3细胞核中。

2.3 转染后NIH3T3细胞的增殖率较转染前NIH3T3增加

用MTT法检测不同组别NIH3T3细胞在570 nm波长下的吸光度，发现经转染了不同重组载体的NIH3T3，经培养24 h、48 h、72 h的吸光度高于未转染的NIH3T3细胞；且同一组别NIH3T3细胞随着培养时间的增加，吸光度逐渐增加。进一步反映出，随时间增加转染后NIH3T3细胞的增殖率高于转染前NIH3T3细胞。见表2。

2.4 转染后NIH3T3细胞的凋亡率较转染前NIH3T3降低

流式细胞仪检测不同组别NIH3T3细胞的凋亡率，NIH3T3/A549-mtDNA组（5.20±0.20）%、NIH3T3/H226-mtDNA组（7.75±0.11）%较NIH3T3组（19.04±0.08）%细胞的凋亡率明显下降（

F

=8 381.21，

P＜

0.001）。说明转染了重组表达载体后，在一定程度上抑制了NIH3T3细胞的凋亡。

3 讨论

肿瘤的发生、发展和人类对肿瘤的易感性、基因突变，遗传物质的改变等多因素密切相关。核DNA（cDNA）是细胞核内的重要遗传物质，具有一定的稳定性，但突变的cDNA通过影响细胞的转录、翻译及蛋白表达变化从而导致肿瘤的发生。MtDNA具有更加脆弱、突变率高的特点，因而，在近年来，突变的mtDNA与肿瘤的发生关系越来越得到国内外学者的关注。Altafi等也报道了mtDNA D-环区几乎全是外显子，长期持续暴露于线粒体高氧浓度的环境中，由于缺乏组蛋白保护和完整的修复系统，mtDNA容易与化学致癌物质结合，造成损伤和突变，同时释放大量活性氧自由基，从而引起肿瘤的发生。人们在鼻咽癌、大肠癌、肝癌、血液系统等多种恶性肿瘤中，在mtDNA D-Loop均检测到的突变或多态性变化位点。虽然先前的文献报道在多种肿瘤细胞或肿瘤组织中发现的mtDNA D-环区的突变，但在具体涉及到肿瘤发生过程中的可能机制则为少见。NIH3T3是研究恶性转化的靶细胞，当肿瘤细胞中提取的DNA导入到该细胞中，能够通过将其恶性转化，从而形成恶性转化灶。在本研究中，为探讨突变的mtDNA D环在肿瘤发生过程中的初步机制，我们通过选取NIH3T3细胞，将突变的肺癌A549、H226细胞的mtDNA的D环区导入其中，通过研究其在细胞中的整合、被转染的NIH3T3细胞染色体核型、增殖率及凋亡率的变化，以期初步探明mtDNA在肿瘤发生演变中的作用。

表2 转染前后小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的570 nm处吸光度变化/±s

有研究报道，在物理、化学及某些生物因素的作用下，mtDNA常会发生缺失和重组，而线粒体膜也可发生破碎、裂解，从而导致胞质中的mtDNA碎片的形成。细胞质中含有大量游离mtDNA及其片段，核酸降解酶活性高，线粒体RNA反转录多。此外，在细胞核中还有核孔和DNA连接酶，当细胞质中DNA酶和DNA酶样物质的数量和质量受到影响时，游离mtDNA或mtDNA片段有机会整合到核DNA中，像一些肿瘤病毒一样，这些核孔会随机整合到核DNA中。Ju发现突变的mtDNA片断随机整合入核基因组可能在肿瘤发生过程中起重要作用。本研究发现，通过FISH法检测到外源性的突变的mtDNA能够随机整合到NIH3T3细胞的核基因组内，引起导致NIH3T3细胞染色体核型发生了突变和断裂，呈多倍体表现。染色体核型部分缺失或者异位异常，可能激活或灭活该部位基因的功能的改变，常引起一些染色体异常相关性疾病。Ardern-Holmes等研究发现2型神经纤维瘤病（NF2）是由于22q12号染色体上NF2基因的突变而形成了中枢神经系统肿瘤。但染色体核型异常与肿瘤的发生关系尚不明确。本研究进一步研究发现外源性突变mtDNA诱导NIH3T3细胞的生物学行为发生变化，具有恶性转化的倾向。主要体现在空NIH3T3和转染了pcDNA3.1（+）-A549 mtDNA、pcDNA3.1（+）-H226 mtDNA的NIH3T3细胞的增殖率升高，而凋亡率则下降。

肺癌细胞突变的mtDNA导入NIH3T3细胞能够导致其生物学行为发生一系列改变，初步具有恶性倾向，表明高突变肺癌mtDNA D环区可诱导NIH3T3细胞恶性转化。