肝细胞生长因子/酪氨酸蛋白激酶MET信号通路与乳腺癌侵袭转移的相关性分析

乳腺癌是女性常见的一种恶性肿瘤，约有24%～60%的乳腺癌病人因为肿瘤转移而死亡。肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）也被称为扩散因子，是具有促有丝分裂的一种独特的生长因子。HCF由间充质细胞所分泌，其受体酪氨酸蛋白激酶MET（c-met）蛋白作为一种阔膜蛋白，存在于多种上皮细胞膜上。当HCF与c-met蛋白发生特异性结合，导致c-met蛋白酪氨酸激酶活性的激活，从而使该通路上多种底物蛋白发生磷酸化，从而调控细胞的增殖和分化。本研究探讨分析HGF/c-met信号通路与乳腺癌侵袭转移的相关性，为了阐明乳腺癌发生发展提供依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年3月至2019年3月承德医学院附属医院临床术后经病理证实的乳腺癌标本75例、乳腺纤维腺瘤标本60例以及癌旁正常乳腺组织标本50例。乳腺癌病理类型均为浸润性导管癌，正常乳腺组织取自乳腺癌根治术后标本距离肿瘤（或肿瘤结节）边缘大于5 cm的区域。75例乳腺癌病人均为女性，年龄（51.93±7.32）岁，范围为33～76岁，其中左乳腺39例、右乳腺36例，肿瘤直径≥2 cm病人33例、＜2 cm病人42例；TNM分期Ⅰ期21例、Ⅱ期25例、Ⅲ期19例、Ⅳ期10例；其中伴有淋巴结转移病人35例、无淋巴结转移病人40例。

1.2 方法

1.2.1

SP免疫组化法 石蜡包埋连续切片4µm，3%过氧化氢孵育10 min封闭灭活内源性过氧化物酶；磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗5 min后将切片放入0.01 mL/L枸橼酸缓冲液中微波抗原修复10 min；加入山羊血清封闭60 min（37℃），滴加适当浓度的一抗，37℃孵育60 min后4℃过夜，PBS洗5 min×3；滴加羊抗兔/鼠IgG二抗，室温孵育15 min，PBS洗5 min×3；3，3"-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，苏木素复染核，封片、观察。使用PBS代替一抗作为阴性对照。

HGF、c-met判断标准：HGF、c-met以正常黏膜上皮细胞或肿瘤细胞质或胞核出现棕黄色颗粒为阳性，阳性表达判断标准：①选取染色均匀的组织区域，在400倍视野下计数着色细胞占视野总细胞的百分数，共随机计数5个视野，取其平均值，按照百分数记分，0分：0%；1分：＞0%～25%；2分：＞25%～50%；3分：＞50%。②按照细胞着色强弱程度评分：0分：不着色；1分：着色弱；2分：中等着色；3分：着色强。按照①、②值之和判断结果，0分：阴性（-）；1～2分：弱阳性（+）；3～4分：中等阳性（++）；5～6分：强阳性（+++）。

β连环素（β-catenin）判断标准：β-catenin在细胞膜、细胞质、细胞核3个部位表达强度进行判断，正常β-catenin表达主要定位于细胞膜，当＞70%细胞膜阳性表达为正常表达，反之为细胞膜表达缺失；当＞10%细胞质或细胞核阳性表达为异位表达。将细胞膜表达缺失以及异位表达均作为异常表达。

1.2.2

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法取100 mg组织（液氮中保存）放入匀浆器中，在冰浴条件下将组织剪碎后立即加入预冷的Trizol提取液1 mL，充分匀浆，根据试剂使用说明提取组织RNA，使用紫外分光光度计定量RNA含量。参照文献设计引物，PCR扩增反应条件为：94℃预变性2 min，94℃45 s、55℃30 s、72℃30 s，共进行35个循环，72℃8 min。将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后使用凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，用目的基因吸光度与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）吸光度比值表示目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 三种组织中各蛋白免疫组化表达情况

HGF、c-met、β-catenin在乳腺癌组织、乳腺纤维腺瘤组织以及癌旁正常乳腺组织中的表达均差异有统计学意义（

P

＜0.05），见表1。

表1 不同乳腺组织样本中各蛋白免疫组化表达情况比较

2.2 三种组织中HGF、c

-

met、

β-

catenin mRNA相对表达情况

在乳腺癌、乳腺纤维腺瘤及癌旁正常乳腺组织中HGF、c-met mRNA相对表达量差异有统计学意义（

P

＜0.05），其中乳腺癌最高、乳腺纤维腺瘤次之；而乳腺癌、乳腺纤维腺瘤以及癌旁正常乳腺组织中β-catenin mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表2、图1。

表2 三种乳腺组织中HGF、c-met、β-catenin mRNA相对表达情况/±s

2.3 HGF表达与乳腺癌病人病理相关性分析

HGF表达阳性率与病人TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小、ER表达、HER-2表达有关（

P

＜0.05）；c-met蛋白表达阳性率与病人TNM分期、淋巴结转移密切相关（

P

＜0.05）；β-catenin蛋白表达异常率与病人TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小密切相关（

P

＜0.05）。见表3。

3 讨论

图1 PCR显示HGF、c-met及β-catenin在75例乳腺癌组织中的表达

目前乳腺癌治疗靶点的研究仍处于起步阶段。HGF可以促进肿瘤细胞的增殖与转移，同时还可促进肿瘤组织周围血管以及淋巴管的形成，从而为肿瘤转移提供通道，对肿瘤的转移可能具有促进作用，并可能与乳腺癌恶变程度有关。HGF由间充质细胞所分泌，其受体c-met蛋白作为一种跨膜蛋白，在多种上皮细胞膜上均有表达。当HGF与c-met蛋白发生特异性结合之后，可激活cmet受体蛋白的酪氨酸激酶活性，调控肿瘤细胞的增殖与分化。β-catenin是一种重要的胞内蛋白，是具有癌基因潜能的转录激活蛋白，同时也是配体蛋白（Wnt）/连环蛋白（Catenin）信号通路中的一种信号转导分子，是细胞间重要的黏附分子之一，在肿瘤发生、发展、侵袭以及迁移过程中具有着重要作用。研究显示，HGF/c-met介导的信号通路可促使Wnt/Catenin信号通路传导分子β-catenin酪氨酸残基发生磷酸化，使β-catenin不能与上皮钙黏素胞内部分结合形成复合体，从而降低细胞间黏附作用，而影响肿瘤组织的侵袭和迁移。

表3 HGF、c-met、β-catenin表达与乳腺癌病人75例临床病理相关性分析/例（%）

本研究结果显示，在乳腺癌组织中，HGF、c-met蛋白表达阳性率显著高于乳腺纤维腺瘤以及癌旁正常乳腺组织，而β-catenin蛋白表达异常率（包括细胞膜表达缺失以及异位表达）显著高于乳腺纤维腺瘤以及癌旁正常乳腺组织。与学者相关研究结果相似，提示在乳腺癌中，HGF/c-met信号通路处于高表达状态，且β-catenin异常表达明显升高。此外，RT-PCR结果显示，HGF、c-met mRNA相对表达量在乳腺癌组织中最高，乳腺纤维腺瘤次之，进一步证实了HGF、c-met在乳腺癌组织中的高表达；而β-catenin mRNA在三种不同组织中的相对表达含量无明显差异，可能考虑β-catenin在正常组织中均有表达，而在乳腺癌组织中出现表现为表达异常，通过RT-PCR法仅代表mRNA表达相对含量，而无法定位具体表达部位。

此外，本研究结果显示，HGF表达阳性率与病人TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小、ER表达、HER-2表达有关（

P

＜0.05）；c-met蛋白表达阳性率与病人TNM分期、淋巴结转移密切相关（

P

＜0.05）；βcatenin蛋白表达异常率与病人TNM分期、淋巴结转移、肿瘤大小密切相关（

P

＜0.05）。HGF、c-met、βcatenin蛋白与乳腺癌疾病进展、肿瘤侵袭转移具有着密切的联系，其中HGF蛋白表达与ER表达、HER-2表达有关，提示HGF/c-met信号通路、βcatenin蛋白可能为乳腺癌侵袭转移的调控机制之一，还需进一步深入研究分析。

综上所述，乳腺癌组织中HGF、c-met蛋白高表达而β-catenin蛋白异常表达，且HGF/c-met信号通路及β-catenin蛋白与乳腺癌侵袭转移密切相关。