微小RNA-590对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制
2021-03-24刘锦
口腔鳞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，约占颌面部恶性肿瘤的90%。近年来，随着以手术为主，放化疗为辅等综合疗法的应用，口腔鳞癌的临床疗效逐渐改善，但中晚期口腔鳞癌病人的5年生存率仍然较低。因此，充分了解口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制，寻找新的诊疗方法，对改善病人预后，提高病人5年生存率意义重大。微小RNAs（miRNAs）是一类由18～22个核苷酸组成的内源性非编码RNA分子。研究发现，miRNAs在细胞增殖、转移、分化和自噬等多种生物学过程中作用显著，其表达异常参与肿瘤发生和进展。吴岩等研究发现口腔鳞癌病人口腔黏膜组织中的miR-590表达水平显著上调，其可能参与了口腔粘膜细胞癌变的过程。但目前miR-590对口腔鳞癌生物行为的影响及其机制还不清楚。因此，本研究通过检测miR-590在口腔鳞癌组织中的表达水平，初步探讨其对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响和可能机制，以期为口腔鳞癌提供有效诊断标志物和治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 实验材料
52例口腔鳞癌组织样本取自2014年1月至2017年1月于菏泽市牡丹人民医院口腔科住院病人，将手术切除获得口腔鳞癌组织及距离肿瘤边缘2 cm的癌旁组织标本，肿瘤组织经病理鉴定为口腔鳞癌，癌旁组织标本经病理鉴定为正常组织。其中男性35例，女性17例；年龄40～75岁，中位年龄为61岁；舌癌30例，口底癌8例，牙龈癌11例，颊癌3例。所有病人术前均未接受化疗和放射治疗。所有病人或其近亲属均知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。Tca-8113细胞购于上海斯信生物科技有限公司；RPMI-1640培养基和胎牛血清为hyclone公司产品；PCR引物，miRNA抑制物阴性对照（anti-miR-NC）、miR-590抑制物（anti-miR-590）、pcDNA3.1、大肿瘤抑制基因1（LATS1）过表达载体（pcDNA3.1-LATS1）、小干扰RNA阴性对照（si-NC）、LATS1小干扰RNA（si-LATS1）以及LATS1野生型荧光素酶报告载体（WTLATS1）和LATS1突变型荧光素酶报告载体（MUTLATS1）的构建测序等均有北京华大基因公司提供；四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）细胞增殖检测试剂盒、RIPA裂解液、购自北京索莱宝公司；Transwell小室购自美国corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；Lipofectamine2000和Trizol试剂，鼠源LATS1、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、P21、上皮钙黏素（E-cadherin）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠Ⅱ抗IgG均购自Invitrogen公司产品。1.2 细胞培养、转染和分组
Tca-8113细胞用RPMI-1640培养基（含有10%的胎牛血清和1%的青链霉素双抗）放入37℃、5%二氧化碳的培养箱培养，当细胞融汇至80%时，胰酶消化后进行传代培养。将对数期Tca-8113细胞接种于6孔板，利用Lipofectamine2000将anti-miR-NC、anti-miR-590、pcDNA3.1和pcDNA3.1-LATS1分别转染至融汇至60%的Tca-8113细胞，依次标记为anti-miR-NC组、antimiR-590组、pcDNA3.1组和pcDNA3.1-LATS1组，培养24～72 h后进行功能实验。为证实miR-590是通过调控LATS1表达参与对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的调控，将si-NC或si-LATS1分别与antimiR-590共转染至Tca-8113细胞，依次标记为antimiR-590+si-NC组和anti-miR-590+si-LATS1，检测抑制LATS1表达能否逆转anti-miR-590对Tca-8113细胞增殖、迁移和侵袭的影响。1.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测
利用Trizol法分别提取52例口腔鳞癌组织和与其对应的癌旁组织及各组Tca-8113细胞的总RNA，测定其浓度后，取1µg的RNA样本利用逆转录试剂盒反转录为互补DNA（cDNA），用SYBR Green PCR试剂盒进行qRT-PCR扩增。以U6为内源性参照，用2法计算miR-590的相对表达量。1.4 MTT法检测细胞活力
各组取2×10个Tca-8113细胞接种96孔板，在培养24、48、72 h时各取出一板细胞，每孔加入MTT溶液20µL。再孵育4 h，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）溶液150µL。在微量振荡振荡10 min直至结晶完全溶解。用全自动酶标仪检测490 nm处吸光度以表示细胞活力。1.5 Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力
迁移实验：用适量RPMI-1640培养液（不含有胎牛血清）重悬细胞。取600µL含10%胎牛血清培养液加入Transwell下室，取300µL的细胞悬液（约含有5×10个细胞）加入上室。常规培养24 h，用棉签擦去上室膜附着细胞，甲醇固定下室膜附着细胞，结晶紫染液染色。将小室倒置于显微镜下，随机选取5个视野进行拍照和计数，取均值为迁移数目。侵袭实验：按照1∶8比例配置Matrigel胶工作液，取50µL加入Transwell小室，室温放置30 min使Matrigel聚合成胶备用。其他步骤同侵袭实验。
1.6 双荧光素酶报告基因检测
生物信息软件预测miR-590与LATS1的3"非翻译区（UTR）存在互补序列。构建含有miR-590结合序列的LATS1-3"UTR的野生型（WT）-LATS1和突变型（MUT）荧光素酶报告载体WT-LATS1、MUT-LATS1。在Tca-8113细胞中利用Lipofectamine2000分别将WT/MUT-LATS1与miR-590 mimics和miR-NC共转染，裂解转染48 h细胞，双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组Tca-8113细胞的相对荧光素酶活性。1.7 蛋白质印迹法（Western blotting）检测
RIPA裂解法获得各组Tca-8113细胞总蛋白，BCA法定量。取30µg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，随后将分离的细胞蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，转膜结束后，在室温条件用Western封闭液孵育30 min，弃去封闭液，用Western洗涤液洗膜10 min，重复3次，然后用已稀释的抗LATS1、GAPDH、CyclinD1、P21、Ecadherin和MMP-2蛋白的Ⅰ抗，室温条件孵育2 h，Western洗涤液再次洗膜后，用稀释好的Ⅱ抗室温条件孵育1 h。利用增强型化学发光试剂盒ECL显影，以GAPDH为内参，Image J软件分析目的蛋白表达量。
2 结果
2.1 miR
-590在口腔鳞癌组织和对应癌旁组织中的表达
口腔鳞癌组织中miR-590的表达水平为（0.73±0.07），与癌旁组织的（0.30±0.03）比较显著降低（t
=40.715，P
＜0.001）。2.2 抑制miR
-590对细胞Tca
-8113增殖、迁移、侵袭的影响
anti-miR-590组Tca-8113细胞miR-590的表达与anti-miR-NC组比较显著下调（P
＜0.05），表明成功构建抑制miR-590表达的Tca-8113细胞株。与anti-miR-NC组比较，anti-miR-590组Tca-8113细胞活力、迁移和侵袭数目、Cyclin D1和MMP-2蛋白表达量显著降低，P21和E-cadherin蛋白表达量显著升高（P
＜0.05），见图1、表1、表2。提示，抑制miR-590能够抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
图1 抑制miR-590对口腔鳞癌细胞Tca-8113增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响
表2 抑制miR-590对口腔鳞癌细胞Tca-8113迁移、侵袭的影响/±s
2.3 miR
-590靶向调控LATS1表达
生物信息学软件预测miR-590的靶基因显示，miR-590可以和LATS1的3"UTR相结合。与miR-NC和WT-LATS1共转染组比较，miR-590 mimics和WT-LATS1共转染后Tca-8113细胞的相对荧光素酶活性显著下降（P
＜0.05）；与anti-miR-NC和MUT-LATS1共转染组相比较，miR-590 mimics和MUT-LATS1共转染后Tca-8113细胞的相对荧光素酶活性差异无统计学意义（P
＞0.05）。miR-590组Tca-8113细胞LATS1蛋白表达量为（0.06±0.01），与miR-NC组的（0.17±0.02）相比显著降低（P
＜0.05）；anti-miR-590组Tca-8113细胞LATS1蛋白表达量为（0.58±0.05）与anti-miR-NC组的（0.19±0.02）相比显 著升高（P
＜0.05）（F
=547.059，P
＜0.05）。见图2、表3。以上结果表明，LATS1是miR-590的靶基因，miR-590可负性调控LATS1表达。
表1 抑制miR-590对口腔鳞癌细胞Tca-8113增殖的影响/±s
图2 miR-590靶向调控LATS1表达：A为LATS1的3"UTR含有miR-590的互补序列；B为miR-590调控LATS1的表达
2.4 过表达LATS1对细胞Tca
-8113增殖、迁移、侵袭的影响
pcDNA3.1-LATS1组Tca-8113细胞LATS1蛋白表达量与pcDNA3.1组比较显著降低，表明过表达LATS1的Tca-8113细胞株构建成功。与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-LATS1组Tca-8113细胞活力、迁移和侵袭数目、Cyclin D1和MMP-2蛋白表达量显著降低（P
＜0.05），P21和E-cadherin蛋白表达量显著升高（P
＜0.05），见图3、表4、表5。提示，过表达LATS1能够抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。注：E-cadherin为上皮钙黏素，MMP-2为基质金属蛋白酶2。
表3 miR-590靶向调控LATS1表达的双荧光素酶报告实验/±s
图3 过表达LATS1对口腔鳞癌细胞Tca-8113增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响
表4 过表达LATS1对口腔鳞癌细胞Tca-8113增殖的影响/±s
表5 过表达LATS1对口腔鳞癌细胞Tca-8113迁移、侵袭的影响/±s
2.5 抑制LATS1能逆转抑制miR
-590对细胞Tca
-8113增殖、迁移、侵袭的抑制作用
与anti-miR-NC组比较，anti-miR-590组Tca-8113细胞LATS1、P21和E-cadherin蛋白的表达显著升高，细胞活力、迁移和侵袭数目、Cyclin D1和MMP-2蛋白表达量显著降低（P
＜0.05）；与anti-miR-590+si-NC组比较，antimiR-590+si-LATS1组Tca-8113细胞LATS1、P21和E-cadherin蛋白的表达显著降低，细胞活力、迁移和侵袭数目、Cyclin D1和MMP-2蛋白表达量显著升高（P
＜0.05），见图4、表6、表7。以上结果表明，抑制LATS1能购逆转抑制miR-590对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。3 讨论
近年来，口腔鳞癌的发病机制受到越来越多研究者的关注。Fu等研究发现，miR-155通过调控p27Kip1表达能够调控口腔鳞癌Tca8113细胞的增殖、周期和凋亡；Rastogi等研究表明下调miR-377通过靶向组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）促进口腔鳞状细胞癌的生长和迁移。此外，Wang等研究者指出miR-139-5p通过靶向同源盒A9（HOXA9）抑制口腔鳞癌细胞的发生和进展。以上研究表明，miRNA在口腔鳞癌的进展中发挥重要作用，探索与口腔鳞癌相关的miRNA，对口腔鳞癌的临床诊疗意义重大。
图4 抑制LATS1能逆转抑制miR-590对口腔鳞癌细胞Tca-8113增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响
miR-590表达异常是恶性肿瘤中常见的分子事件。miR-590在结肠癌中呈高表达，其与肿瘤临床病理分期分期及远处转移呈正相关，并通过抑制Wnt抑制因子1（WIF1）和分泌性蛋白Dikkopf-1（DKK1）表达激活Wnt/β-catenin信号通路对结肠癌细胞增殖起正性调控作用；在肝癌细胞中，miR-590也呈高表达，下调miR-590可引起肝癌细胞周期阻滞，抑制肝癌细胞生长，增加细胞的化疗敏感性；此外，miR-590在卵巢癌中也发挥癌基因作用。然而，在乳腺癌细胞中，miR-590表达下调，过表达miR-590可抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡，在控制乳腺癌进展和骨转移方面具有潜在的临床应用价值；过表达miR-590还可抑制胶质母细胞瘤的迁移、侵袭和上皮间充质转化。本研究发现，miR-590在口腔鳞癌组织中表达水平显著升高，抑制miR-590表达能够抑制Cyclin D1、MMP-2蛋白，促进P21和E-cadherin蛋白表达，进而降低口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。以上研究首次揭示了miR-590在口腔鳞癌进展中的作用。
表6 抑制LATS1能逆转抑制miR-590对口腔鳞癌细胞Tca-8113增殖的影响/±s
表7 抑制LATS1能逆转抑制miR-590对口腔鳞癌细胞Tca-8113迁移、侵袭的影响/±s
为了解miR-590调控口腔鳞癌的分子机制，用生物信息学软件进行miR-590靶基因预测发现，LATS1是miR-590的潜在靶基因。LATS1是近年来发现的抑制肿瘤发生发展的激酶，其与白血病、星形细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤相关。在肾癌中，沉默LATS1促进肿瘤细胞的恶性表型，促进肾癌细胞的增殖和转移。在口腔鳞癌中，LATS1基因通过启动子甲基化而下调，LATS1的表达下调与肿瘤的大小、分化程度以及是否有淋巴结转移相关。本研究发现，miR-590可靶向负性调控LATS1的表达。过表达LATS1可抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。实验表明，抑制LATS1显著减弱抑制miR-590对口腔鳞癌细胞恶性生物学行为的抑制作用。提示miR-590通过靶向LATS1参与对口腔鳞癌进展的调控。
综上所述，miR-590在口腔鳞癌组织中呈高表达，抑制miR-590通过靶向LATS1可抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭，从而阻碍口腔鳞癌进展。miR-590有望成为口腔鳞癌的新的诊疗靶点。
