长链非编码RNA SNHG16靶向微小RNA-7-5p对喉癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

喉癌是临床常见恶性肿瘤之一，随着现代生活节奏的加快，喉癌发病率逐年升高，严重威胁人类生命安全，目前临床采用手术切除联合放化疗等方法治疗喉癌，但缺乏针对喉癌晚期病人的有效治疗方法。因而寻找潜在靶点成为喉癌治疗领域的重点研究问题。近年来，微小RNA（microRNA，miRNA）作为内源性非编码RNA分子，可通过调控下游靶基因表达而参与喉癌等多种肿瘤发生及发展过程，与miRNA相似，长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）可通过调控基因转录及翻译而参与细胞增殖、凋亡等过程。研究表明LncRNA SNHG16在结肠癌、乳腺癌、口腔鳞癌等多种肿瘤细胞中呈高表达，沉默SNHG16可抑制乳腺癌、口腔癌等肿瘤细胞迁移及侵袭。研究表明miR-7在喉癌中呈低表达，过表达miR-7可通过调控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路而抑制肿瘤细胞迁移及侵袭。通过STARBASE软件预测显示miR-7-5p可能是SNHG16的靶基因，因此，本研究主要探讨SNHG16与miR-7-5p的靶向调控关系及其对喉癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，为喉癌基因治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 病例资料与实验细胞

选取2016年1月至2016年12月重庆医科大学附属第三医院收治的25例喉癌病人为研究对象，所有病人均经病理证实为喉鳞状细胞癌，其中男15例，女10例，年龄（67.32±5.62）岁，范围为50～72岁。所有病人术前均未接受放疗或化疗等治疗。所有病人均进行随访（随访截止日期为2019年6月），并统计总体生存期（OS），根据SNHG16、miR-7-5p表达水平分为SNHG16高表达组（18例）、低表达组（7例）与miR-7-5p高表达组（5例）、低表达组（20例），SNHG16高表达组病人生存率（33.33%）显著低于低表达组（71.43%）（

P

＜0.05）；miR-7-5p高表达组病人生存率（60.00%）显著高于低表达组（35.00%）（

P

＜0.05）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，所有病人知情且签署同意书。所有病人均接受手术治疗，于术中切取喉癌组织及其相应癌旁组织，放入液氮中保存，术后将组织标本转移至-80℃超低温冰箱内保存。喉癌Hep-2细胞购自上海通派生物科技有限公司，Hep-2细胞培养于含有10%胎牛血清及青霉素-链霉素混合溶液的DMEM完全培养基，置于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养，待细胞生长密度达到60%～70%时进行传代培养。

1.2 材料

转染试剂Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher公司；SNHG16小干扰RNA（si-SNHG16）、miR-7-5p抑制剂（anti-miR-7-5p）及其各自阴性对照均购自上海吉玛；双荧光素酶活性检测试剂盒购自上海翊圣生物；荧光素酶报告基因载体购自美国Promega；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）购自美国Sigma；Transwell小室与Mgteigel基质胶购自美国BD；Trizol、反转录及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、P21、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、上皮钙黏素（E-cadherin）抗体购自美国CST；二抗购自北京中杉金桥生物。

1.3 方法

1.3.1

细胞转染及实验分组 收集对数生长期喉癌Hep-2细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬浮液，以每孔3×10/mL的密度接种至6孔板，放入37℃、5%二氧化碳培养箱培养，待细胞生长汇合达到50%时进行转染，转染前更换为Opti-MEM减血清培养基，喉癌Hep-2细胞按照随机数字表法分为四组：si-NC组（转染无意义干扰序列si-NC）、si-SNHG16组（转染si-SNHG16）、si-SNHG16+anti-miR-NC组（共转染si-SNHG16与anti-miR-NC）、si-SNHG16+anti-miR-7-5p组（共转染si-SNHG16与anti-miR-7-5p），转染6 h，更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，继续培养48 h，收集转染成功的细胞进行功能验证。

1.3.2

qRT-PCR检测细胞中SNHG16、miR-7-5p表达水平 取冻存喉癌及癌旁组织，液氮中研磨，同时收集各组喉癌Hep-2细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，分别加入Trizol试剂，依次分别加入200µL氯仿、500µL异丙醇，4℃，12 000 r/min转速离心15 min，提取组织或细胞总RNA，参照反转录试剂盒将总RNA反转录合成互补DNA（cDNA），以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，用2法计算SNHG16、miR-7-5p相对表达量。

1.3.3

四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测细胞增殖 收集对数生长期喉癌Hep-2细胞按照100微升/孔接种于96孔板，分别在培养24 h、48 h、72 h时加入MTT溶液（20微升/孔），继续培养4 h，每孔分别加入150µL二甲基亚砜（DMSO），振荡混匀后应用酶标仪检测490 nm波长处各孔吸光度。每组设置3个复孔，实验设置3次重复。

1.3.4

Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 细胞侵袭：取100µLMatrigel基质胶稀释液铺于内室，Hep-2细胞（2×10/mL）200µL细胞悬液接种于上室，取500µL含胎牛血清的DMEM培养液加入下室，24 h后多聚甲醛固定15 min，结晶紫溶液染色5 min，显微镜下随机选取10个视野观察侵袭细胞数。细胞迁移：无须加入Matrigel基质胶稀释液，后续实验步骤同侵袭实验。

1.3.5

荧光素酶报告基因检测SNHG16、miR-7-5p靶向关系 STARBASE软件预测SNHG16可能结合靶基因，预测结果显示miR-7-5p与SNHG16的3"非翻译区（UTR）存在结合位点，构建SNHG16-3"UTR野生型及其突变型荧光素酶报告载体（WT-SNHG16、MUT-SNHG16），WT-SNHG16、MUT-SNHG16分别与miR-7-5p mimics、miR-NC共转染至喉癌Hep-2细胞，参照荧光素酶活性检测试剂盒测定细胞相对荧光素酶活性。

1.3.6

蛋白质印迹法（Western blotting）检测cyclin D1、P21、MMP-2、E-cadherin蛋白表达 提取喉癌Hep-2细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性，取30µg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，封闭1 h，加入蛋白一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，TBAT洗涤，加入二抗（1∶2 000），TBST洗涤，ECL显色，曝光，应用Quantityone软件检测条带灰度值。

2 结果

2.1 SNHG16、miR

-

7

-

5p在喉癌组织及癌旁组织中的表达

qRT-PCR检测结果显示，相对于癌旁组织，喉癌组织中SNHG16的表达水平升高，miR-7-5p的表达水平降低（

P

＜0.05），见表1。

表1 长链非编码RNA SNHG16、miR-7-5p在喉癌组织及癌旁组织中表达/±s

2.2 抑制SNHG16对喉癌细胞Hep

-

2增殖的影响

喉癌Hep-2细胞中抑制SNHG16表达后，相对于si-NC组，细胞中SNHG16表达水平降低（

P

＜0.05），提示转染成功。与si-NC组相比，si-SNHG16组细胞增殖能力降低，cyclin D1蛋白表达水平降低，而P21蛋白表达水平升高（

P

＜0.05）。见图1、表2。

图1 抑制SNHG16对喉癌细胞Hep-2增殖蛋白表达的影响

2.3 抑制SNHG16对喉癌细胞Hep

-

2迁移、侵袭的影响

相对于si-NC组，si-SNHG16组喉癌Hep-2细胞迁移及侵袭细胞数减少（

P

＜0.05）；与si-NC组相比，si-SNHG16组喉癌Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达水平降低，而E-cadherin蛋白表达水平升高（

P

＜0.05），见图2、表3。

图2 抑制长链非编码RNA SNHG16对喉癌细胞Hep-2迁移、侵袭蛋白表达的影响

表3 抑制长链非编码RNA SNHG16对喉癌细胞Hep-2迁移、侵袭的影响/±s

表2 抑制长链非编码RNA SNHG16对喉癌细胞Hep-2增殖的影响/±s

2.4 SNHG16靶向、调控miR

-

7

-

5p的表达

STARBASE软件预测SNHG16可能调控的miRNA，预测结果显示miR-7-5p可能是SNHG16的靶基因，见图3。双荧光素酶报告实验结果显示，相对于WT-SNHG16、miR-NC共转染组，WT-SNHG16、miR-7-5p mimics共转染组细胞荧光素酶活性降低（

P

＜0.05）；与MUT-SNHG16、miR-NC共转染组相比，MUT-SNHG16、miR-7-5p mimics共转染组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（

P

＞0.05），见表4。qRT-PCR检测结果显示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-SNHG16组细胞中miR-7-5p表达水平降低［（0.18±0.02）比（0.04±0.01）］（

P

＜0.05）；与si-NC组相比，si-SNHG16组细胞中miR-7-5p表达水平升高［（0.19±0.02）比（0.53±0.05）］（

P

＜0.05）（

F

=306.118，

P

＜0.001）。

图3 STARBASE软件预测长链非编码RNA SNHG16可能结合的靶基因——miR-7-5p

表4 双荧光素酶报告实验检测长链非编码RNA SNHG16与miR-7-5p靶向关系/±s

2.5 抑制miR

-

7

-

5p表达能逆转抑制SNHG16对喉癌细胞Hep

-

2增殖、迁移、侵袭的影响

为探究SNHG16是否可通过调控miR-7-5p而参与喉癌Hep-2细胞增殖、迁移及侵袭过程，结果显示，与si-SNHG16+anti-miR-NC组相比，si-SNHG16+anti-miR-7-5p组喉癌Hep-2细胞中miR-7-5p表达水平降低（

P

＜0.05），进一步研究显示，喉癌Hep-2细胞中共转染si-SNHG16与anti-miR-7-5p后，相较于si-SNHG16+anti-miR-NC组，细胞增殖能力显著升高，迁移及侵袭细胞数增加（

P

＜0.05），cyclin D1、MMP-2蛋白表达水平升高，而P21、E-cadherin蛋白表达水平降低（

P

＜0.05），见图4、表5，表6。

图4 抑制miR-7-5p表达能逆转抑制长链非编码RNA SNHG16对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响

3 讨论

部分LncRNA可作为喉癌早期诊断及评估病人预后的分子标志物，LncRNA还可能作为肿瘤治疗新靶点。研究表明LncRNA、miRNA异常表达与喉癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为密切相关。因此本研究通过RNA干扰技术靶向抑制喉癌细胞中SNHG16的表达，检测细胞增殖、迁移及侵袭能力的改变，为揭示SNHG16在喉癌发生及发展中的作用机制提供理论基础。

SNHG16在胃癌组织中呈高表达，其高表达量与病人临床病理特征及预后不良密切相关，进一步研究发现敲低SNHG16表达后，喉癌细胞周期阻滞于G1期，抑制细胞生长。研究表明SNHG16可作为致癌基因，通过竞争性吸附miR-216-5p而调节miR-216-5p/ZEB1信号轴进而促进宫颈癌进展。与上述研究结果相似，本研究结果表明SNHG16在喉癌组织中的表达水平明显升高，喉癌细胞中抑制SNHG16表达后，细胞增殖、迁移及侵袭能力明显降低，说明抑制SNHG16表达可减缓喉癌发展进程。提示SNHG16表达水平升高可能与病人生存期及不良预后密切相关。研究表明细胞过度增殖与细胞周期失控密切相关，细胞周期时间顺序为G1期、S期、G2期、M期，细胞周期相关蛋白可调控细胞周期进程，cyclin D1属于原癌基因，可与周期蛋白依赖性激酶（CDK4）结合形成复合物而促使细胞周期从G0/G1期进入S期，P21可抑制cyclin D1与CDK4结合从而抑制细胞周期进程。本研究结果显示抑制SNHG16表达后，喉癌细胞中cyclin D1表达量降低，P21表达量升高，提示抑制SNHG16表达可通过下调cyclin D1表达及上调P21表达进而抑制喉癌细胞增殖。上皮-间质转化（EMT）可促进肿瘤细胞迁移及侵袭，E-cadherin是细胞上皮标志物，E-cadherin表达下调表明细胞发生EMT进而增强其迁移及侵袭能力，同时MMP-2等基质金属蛋白酶与细胞迁移及侵袭密切相关。本研究结果显示，抑制SNHG16表达后，喉癌细胞中MMP-2表达水平降低，Ecadherin表达水平升高，说明抑制SNHG16可通过下调MMP-2表达及上调E-cadherin表达而抑制喉癌细胞迁移及侵袭。提示SNHG16可能作为喉癌基因治疗的潜在靶点。

表5 抑制miR-7-5p表达能逆转抑制长链非编码RNA SNHG16对喉癌细胞Hep-2增殖的影响/±s

表6 抑制miR-7-5p表达能逆转抑制长链非编码RNA SNHG16对喉癌细胞Hep-2迁移、侵袭的影响/±s

miR-7-5p在乳腺癌细胞中呈低表达，miR-7-5p过表达可通过靶向EGFR而抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭能力。miR-7-5p还可抑制膀胱癌发生及发展进程。LncRNA ZFAS1通过靶向miR-7-5p而调控结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡过程。本研究结果表明miR-7-5p在喉癌组织中呈低表达，说明miR-7-5p表达降低可能促进喉癌发生。提示miR-7-5p表达水平降低可能与病人生存期及不良预后密切相关。为进一步揭示SNHG16在喉癌中的潜在作用机制，双荧光素酶报告实验与qRT-PCR实验证实SNHG16可负向调控下游靶基因miR-7-5p的表达，同时本研究结果表明抑制miR-7-5p表达可逆转抑制SNHG16对喉癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。提示抑制SNHG16表达可通过上调miR-7-5p表达而降低喉癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

综上所述，喉癌组织中SNHG16呈高表达，而miR-7-5p呈低表达，抑制SNHG16可促进miR-7-5p表达，抑制喉癌细胞增殖、迁移及侵袭，为SNHG16与miR-7-5p确定相互作用位点奠定理论基础，可为喉癌基因治疗提供潜在靶点。但SNHG16在喉癌中的作用是由多种因素共同作用引起的，本研究仅通过体外细胞实验进行初步分析，而体内作用及其相关作用机制仍需深入研究。