SSU72参与气孔大小发育和干旱胁迫应答

刘亚男，陈 兰，丁 勇

参与气孔大小发育和干旱胁迫应答

刘亚男，陈 兰，丁 勇*

(中国科学技术大学生命与医学部，中国科学技术大学生命科学学院，合肥微尺度国家物理科学实验室分子细胞生物物理研究所，合肥 230027)

植物在受到外界环境干旱胁迫时，会启动一系列的生理反应，包括气孔的关闭和ABA的产生，然而，植物如何平衡干旱胁迫和生命周期，并不清楚。编码C末端结构域(C-terminal domain , CTD)的磷酸化酶，抑制拟南芥()的开花时间。研究发现72参与拟南芥的干旱胁迫应答，SSU72定位于细胞核中，功能缺失的SSU72失水速率快、气孔大，并且气孔的关闭对ABA不敏感；进一步检测下游的基因,,和的表达水平，表明参与ABA和非ABA途径干旱基因的激活。因此，很可能是对环境适应的重要调节因子，平衡非生物胁迫和生长周期。

基因；气孔；干旱胁迫；ABA

植物生长在外界环境中，易受到多种环境因素的影响，其中干旱胁迫是植物生长发育过程中最重要的胁迫之一，也是作物减产的重要危害[1]。在干旱过程中，植物通过关闭气孔，增加次生物质合成减少对细胞的伤害，同时通过激活下游干旱应答基因来减少对个体的胁迫伤害[2-3]。脱落酸（ABA）参与植物各个生长阶段的生长和发育过程，包括种子发育、休眠、发芽和幼苗生长在内的多个过程[4-6]。在ABA缺乏的时候，信号蛋白Sucrose nonfermenting 1 (SNF1)-related protein kinase 2 (SnRK2)的活性受PP2C磷酸酶抑制[7-8]。ABA存在时， PYR / PYL / RCAR受体感知并结合ABA，改变其构象，解除PP2C对SnRK2s蛋白的抑制，SnRK2s被激活，促进气孔关闭，并激活下游应答基因的表达水平[9-10]。

RNA聚合酶II（RNA Pol II）最大亚基Rpb1的C末端结构域(C-terminal domain , CTD)与RNA聚合酶II的功能至关重要。CTD 由七肽Y1S2P3T4S5P6S7的串联重复组成[11-12]。 CTD序列的数量随着生物体的复杂性而变化，从芽殖酵母中的26个到人类中的52个不等[11,13]。在转录起始时，第5位的丝氨酸被磷酸化，RNA聚合酶II被激活。当RNA聚合酶II离开启动子后，出现了短暂的停留过程，在这个过程中，第5位丝氨酸磷酸化被去除[14]，第2位丝氨酸被磷酸化，转录进入延伸状态。因此，CTD的磷酸化和去磷酸化对转录至关重要[12]。SSU72编码一个去磷酸酶，从酵母至哺乳动物中都很保守。在酵母中SSU72主要去除转录过程中第5位CTD的磷酸化[14]。此外，还可以去除第7位CTD的磷酸化[15]。但在植物中，的研究较少。Tian等在2019年的研究结果表明，可以反向调节FCA与长非编码RNA的结合，抑制位点的H3第27位甲基化的形成，抑制拟南芥()开花时间[16]。本研究以拟南芥为供试材料，通过模拟干旱条件，利用分子生物学等技术方法，研究在干旱胁迫应答中的功能，以期了解植物在干旱胁迫时如何平衡干旱胁迫和生命周期。

1 材料与方法

1.1 材料

(SALK_120634) 和(SAILseq_ 588_A01.1)突变体来自于ABRC突变体库, 拟南芥生长于22 ºC中，光周期为16 h光照/8 h黑暗的温室。

1.2 方法

1.2.1 叶片失水观察 培养3～4周的拟南芥，取第5片叶20片，放在不同的称量纸上，正面朝上10片，反面朝上10片，前1小时每15 min记录1次叶片的重量，第2 至第3小时每隔30 min记录1次，第4小时末记录1次。将每次的称重与新鲜叶片重量对比后，绘制叶片失水曲线。实验设计3个重复。

1.2.2 气孔开张度观察 叶片气孔观察：20 mmol·L-1KCl，100 mmol·L-1CaCl2，100 mmol·L-1Mes-KOH按照193:2:5的比例配置气孔buffer，将叶片朝上放置在气孔buffer中，强光下照射2 h，随后在不同气孔buffer样品内加入不同浓度的ABA，继续强光下照射2 h；用镊子撕取表皮并在显微镜下进行观察。

1.2.3 蛋白定位 参照Yoo等[17]的方法构建拟南芥叶肉原生质体；将SSU72蛋白的CDS构建到PUC19-GFP载体中，并得到纯度较高的质粒。将质粒转入拟南芥原生质体，黑暗培养10～12 h，于共聚焦显微镜 (ZEISS Xradia 810)下观察。

表1 PCR和qRT-PCR的引物序列

1.2.4 RNA提取以及定量PCR分析 取生长16 d的野生型和突变体整株幼苗，并将幼苗根部的土清理干净，放置于培养皿中，于22 ℃温室中强光照射，干旱处理2 h。将干旱处理后的叶片放置于研钵中，加入液氮研磨至发白将干，采用Trizol （TransGen Bio-tech）试剂提取植物叶片总RNA，并反转录为cDNA。以SYBR superMix试剂盒（TransGen Bio-tech），利用定量PCR仪器(Bio-Rad)上扩增，以UBQ为内参，并通过2–∆∆Ct计算相对表达量。

2 结果与分析

2.1 ssu72突变体叶失水速率更快

为了研究的功能，我们获得了2个T-DNA插入的突变体，基因型分析结果显示，T-DNA插入位于第1个外显子上(图 1A和B)。RT-PCR结果显示，这2个突变体是功能缺失性的突变体 (图 1C)，并且具有早开花的表型（图 1D）。通过离体叶片失水实验显示，突变体的失水速率更快，野生型叶片在空气中暴露3 h，叶片重量约为初始重量的70%，而突变体叶片仅占初始叶片重量的50%左右(图 1E)，表明突变体可能具有更大的气孔。

A. SSU72基因的结构示意图(外显子用黑色框表示，内含子用直线表示，T-DNA的插入用三角形表示，用于基因型的检测的引物用箭头表示)；B. ssu72突变体的基因型鉴定； C. ssu72突变体中SSU72的转录水平；D. 长日照下，33 d的ssu72突变体的开花表型；E. 不同时间下，ssu72突变体叶片含水量（在空气干旱处理后，不同时间叶片的重量与初始时的比值，SEM = 3）。

Figure 1 The characterization ofmutants, expression ofand the change of water content

A. 不同ABA浓度处理下ssu72突变体的气孔大小示意图；B. ssu72突变体的气孔密度示意图；C. 单位视野里ssu72突变体的气孔密度统计(n≥ 50)；D. 不同ABA浓度处理下的ssu72突变体的气孔大小统计(n≥ 50)。

Figure 2 The stomata number and size in wild type andmutants

2.2 SSU72参与气孔大小的形成

为了验证这一结果，我们分别观察野生型和突变体叶表皮的气孔大小，发现突变体气孔开张度比野生型大(图 2A)，而气孔的密度并没有明显的变化 (图 2 B和C)。表明SSU72通过调节表皮气孔开张度的大小，影响叶片水分蒸腾的速率。进一步用不同浓度ABA处理，发现野生型和突变体的气孔，随着ABA浓度的增加，气孔开张度都在减小 (图 2A和D)，而突变体的气孔的减小，要比野生型慢，表明SSU72功能缺失导致拟南芥失去对ABA的正常反应。

2.3 SSU72编码一个核定位蛋白

SSU72编码一个CTD去磷酸酶，与酵母、哺乳动物中相应蛋白具有高度的同源性(图 3A)。为了进一步研究其功能，将SSU72与GFP融合，并转化原生质体，在激光共聚焦显微镜下进行观察，发现SSU72定位与DAPI信号高度一致，表明SSU72定位于细胞核中（图 3B至D）。该实验表明SSU72蛋白功能可能是保守的，即很可能通过去除CTD的磷酸化和RNA聚合酶II活性，进而调节相应基因表达。

A. 酿酒酵母、拟南芥、智人、水稻、小鼠的SSU72蛋白序列比较；B. 拟南芥原生质体中的SSU72与GFP融合的信号；C. DAPI染色信号；D. 二者重叠后的信号（Bar =10 µm）。

Figure 3 Comparison of SSU72 proteins from Arabidopsis with other species and its localization to the nucleus

图4 非干旱和干旱胁迫下相关基因表达水平的检测

Figure 4 Related gene mRNA levels with or without dehydration stress

2.4 SSU72激活下游的干旱诱导基因

为了验证是否激活下游基因的表达，我们分别将野生型和突变体通过2 h的空气干旱处理，并提取RNA，检测下游的基因表达水平。结果发现在突变体中，ABA通路的、和基因，在干旱前后，表达水平都有所下调；而非ABA通路中的和基因，同样在干旱前后都有所下调，表明可能参与了ABA通路和非ABA通路。我们进而检测了信号通路上游的基因、和，未发现明显的变化，可能是由于SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6蛋白的活性，大多数情况下受翻译后调控。此外，ABA合成的限速酶的表达水平也没有发生明显的变化（图4）。

3 讨论

植物为了有效地应对干旱胁迫，启动了一系统机制来适应并逃避这一不利的局面，如合成多种次生物质(脯氨酸)等，同时关闭气孔并提前开花结实，维持下一代的繁衍[18]。前期研究显示，拟南芥突变体具有早花的表型，SSU72抑制植物的开花时间；我们的研究则显示突变体叶片失水速率更快且拥有更大的气孔，在ABA胁迫下，SSU72促进气孔的关闭。表明基因很可能是介导干旱胁迫和开花时间的重要调控因子，参与植物的开花时间和干旱胁迫途径，从而增强对环境的适应性。

SSU72磷酸酶在酵母到哺乳动物中都很保守，对于基因的转录是必需的，SSU72与转录因子IIB相互作用，转录因子IIB参与RNA聚合酶II前启动复合物的形成[19-20]。在干旱胁迫过程中，一系列干旱应答基因快速上调，而SSU72作为一个CTD磷酸化酶对RNA聚合酶II的延伸极为重要，我们的研究也证明拟南芥SSU72蛋白定位在细胞核中且与酿酒酵母、水稻和哺乳动物具有高度的同源性，表明拟南芥SSU72蛋白很可能与哺乳动物和酵母中的SSU72蛋白功能是类似的，但这一推测还需要更加复杂严谨的实验证实。我们还发现在突变体中，多个干旱基因在干旱胁迫过程中，转录水平不能有效地上调，很可能是由于的缺失而导致转录无法正常进行，但要证明这一点，还需要进一步解析如何特异地结合一系列干旱应答基因，这需要进一步深入研究蛋白互作的网络，找到将SSU72与干旱信号通路连接的蛋白。

ABA依赖的信号级联由ABA受体对ABA的感应引发，最广泛的模型是PP2C和SnRK2激酶的相互作用，激活的SnRK2s磷酸化下游靶基因并触发ABA诱导的生理反应[21]。本研究结果表明，可能参与了ABA依赖的干旱信号通路，但同时在2.4结果中，非ABA信号通路的蛋白表达也有所下调，说明可能还参与了非ABA依赖的干旱信号通路。参与干旱通路可能是直接的也可能是间接的，还需要更多强有力的实验证实。

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is involved in stomata development and dehydration stress

LIU Yanan, CHEN Lan, DING Yong

(School of Life Sciences, USTC Life Sciences and Medicine, Hefei National Laboratory for Physical Sciences at the Microscale, University of Science & Technology of China, Hefei 230027)

The plant physiological adaption including stomata closure and elevated ABA concentration is crucial for survival in response to dehydration stress, however, how plant balances the dehydration and life cycle remains unclear. Here, we reported thatencoding a C-terminal domain (CTD) phosphatase is involved in flowering time. The results showed that: under dehydration stress,, localized on the nucleus,was involved in dehydration stress, and the loss offunction displayed the larger stomata size and increase of the water loss. In addition, the stomata opening was hyposensitive to ABA treatment. The transcripts of dehydration response genes,,,and, were reduced inmutant with or without dehydration stress, indicatinmay activate drought stress response in ABA and non-ABA pathways. Together, our study provides a new insight thatmight be a novel factor involving in environmental adaptation, balancing abiotic stress and growth cycle.

; stomata; dehydration stress; ABA

Q945.78

A

1672-352X (2021)06-0873-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.003

2022-1-7 8:01:56

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1230.006.html

2021-04-08

安徽省大学协同创新计划（GXXT-2019-033）和国家自然科学基金（32000242，32000241，31871278 和U19A2021）共同资助。

刘亚男，硕士研究生。E-mail：aianhong@163.com

通信作者:丁 勇，教授，博士生导师。E-mail：dingyong@ustc.edu.cn