CTLA-4基因多态性与肾癌易感性的相关性研究

刘 琦 赵灵燕 程佳颖 周旭颖 隋 静 高玉敏

肿瘤发生和发展的重要机制之一是免疫监视功能的损害[1]，而与免疫系统有直接联系肿瘤之一是肾癌(renal cell cancer，RCC)。全球每年有超过10万人死于肾肿瘤[2]，其中>90%是肾癌；我国肾癌发病死亡水平较低，但较以往有巨大上升[3]。细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)基因存在于编码免疫调节分子的染色体2q33上，由四个外显子组成，它们编码不同的功能结构域：先导序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域[4]。此前的研究证据表明，CTLA-4在T细胞增殖和活化的负调控中起着关键作用，通过其在T调节细胞上的组成性表达间接控制效应T细胞[5]。然而，CTLA4也可能提高T细胞活化阈值，从而抑制抗肿瘤免疫，增加肿瘤易感性[6]。CTLA-4中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与自身免疫性疾病和癌症的易感性有关[7-8]。

此前的研究证实了CTLA-4基因多态性与多种癌症[8-12]的易感性相关。到目前为止国内鲜有研究显示CTLA-4基因多态性与肾癌的关系。本研究将探讨CTLA-4基因rs5742909、rs231775位点与肾癌易感性的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

采用病例对照研究方法，于2018年至2019年分别收集内蒙古医科大学附属医院和内蒙古自治区人民医院新发肾癌患者96例，均经病理组织学确诊，并以问卷调查的形式记录人口学资料，排除其他肿瘤史者、患血液病及自身免疫病者、转移而来的肾癌者、术前放疗者。按照1∶1匹配原则，选择对照人群96例，为同时期前来该医院体检中心期体检的健康人群，均无恶性肿瘤史、血液病及自身免疫病史者。两组人群性别、民族匹配，年龄相差3岁，且彼此之间无血缘关系。所有研究对象均签署书面知情同意书，本研究获内蒙古医科大学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 按照DNA快速提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)的步骤从静脉血中提取基因组DNA，并经紫外线分光光度计定量。上海生工生物工程股份公司预先设计了引物，对CTLA-4基因rs5742909、rs231775两个位点进行扩增，采用多重高温连接酶检测反应技术(imLDR)技术对基因进行分型检测。产物由上海天昊生物科技有限公司测序确认。

1.2.2 Hardy-Weinberg平衡 CTLA-4基因rs574290-9、rs231775位点在肾癌组和对照组人群中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.298、0.686)。

1.3 统计学分析

使用拟合优度χ2进行Hardy-Weinberg平衡检验，以方差分析或者χ2检验统计病例组与对照组之间的人口分布的特征及基因型频率的差异，使用多因素条件Logistic回归模型计算比值比(odds ratio，OR)和相应的95%可信区间(confidence interval，CI)来评估各基因型及有关因素与肾癌发病风险的关系。连锁不平衡及单倍型分析使用SHEsis在线软件。P<0.05时认为差异具有统计学意义。所有数据处理均使用SPSS 25.0统计软件完成。

2 结果

2.1 研究对象基本情况

病例组年龄为(59.6±11.1)岁，男性59例，女性37例；对照组年龄为(60.2±11.2)岁，男性58例，女性38例。两组间性别、年龄、荤素搭配、食用水果分布差异无统计学意义(P>0.05)；饮用牛奶和体育锻炼行为的差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

表1 病例组和对照组的一般情况比较(例，%)

2.2 基因型及等位基因频率分布

rs5742909、rs231775位点基因型和等位基因频率在两组的分布差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 条件Logistic回归

将两个位点及两组差异具有统计学意义的饮用牛奶、体育锻炼因素纳入Logistic回归模型中(表3)。结果表明，rs5742909位点及饮用牛奶进入模型，rs231775位点、体育锻炼因素被剔除。其中饮用牛奶因素P=0.015，OR(95% CI)为2.65(1.212～5.779)，提示几乎不饮用牛奶为患肾癌的危险因素。另外，在对照组中，rs5742909位点C等位基因的频率较高[P=0.006，OR=0.443，95%CI 为(0.237～0.792)]；而在病例组中，rs231775位点A等位基因更为常见[P=0.009，Or=1.781，95%CI为(1.154～2.749)](表3)。

表2 CTLA-4基因2个位点基因型及等位基因频率在病例组与对照组中的分布(例，%)

表3 Logistic回归模型分析膀胱癌危险因素(例，%)

2.4 位点连锁不平衡及单倍型分析

结果显示，rs5742909与rs231775间的D’值为0.967，提示这两个位点间存在强连锁不平衡关系。CTLA-4基因两个位点单倍型频率分布比较可得，C-G和T-A两个单倍型具有统计学意义(P=0.007、0.008)，在C-G和T-A单倍型分布下，患病风险分别为其他单倍型的0.556倍[OR(95%CI)为0.556(0.360～0.858)]和2.230倍[OR(95%CI)为2.230(1.216～4.089)，见表4。

表4 CTLA-4基因单倍型频率分布差异(例，%)

3 讨论

肾癌的发生发展涉及多种因素的参与作用，环境因素与遗传因素的交互或共同作用是大多数肿瘤的病因，但暴露于相同环境的人群只有少数个体发病，提示个体的遗传易感因素起更重要作用[3]。研究表明，慢性感染和炎症是癌症的主要病因，当炎症免疫反应与肿瘤发生有关时，CTLA-4在活化的T细胞上的存在起着“关闭开关”的作用，以保持免疫系统处于正常状态。CTLA-4可以被认为是1种“双刃剑”，只有其最佳表达才能保证高效同时无害的免疫应答。CTLA-4基因在易患癌症及自身免疫疾病的遗传和环境易感性个体中的异常表达可能增加疾病发生和发展的风险[13]。考虑到单核苷酸多态性在CTLA-4基因表达蛋白质功能中的意义，假设这些SNPs参与肾癌的发生和发展。

基因多态性与乳腺癌、宫颈癌和慢性淋巴细胞白血病等多种恶性肿瘤的易感性有关[13]，但在肾癌中研究甚少。本研究评估了CTLA-4基因rs5742909与rs231775位点与中国汉族人肾癌易感性的关系，两位点基因型和等位基因频率在两组的分布差异均有统计学意义(P<0.05)，但Logistic回归结果尚未发现两位点与肾癌易感性相关，rs5742909位点C等位基因在对照组中的分布频率显著高于病例组，可能与肾癌患病风险降低有关[P=0.006，OR(95% CI)为0.443(0.237～0.792)]。rs231775位点A等位基因在病例组的分布频率显著高于对照组，可能与肾癌患病风险增加有关[P=0.009，OR(95% CI)为1.781(1.154～2.749)]。

另外，本研究分析了病例组人群和对照人群在某些生活习惯如荤素搭配、饮用牛奶、食用水果、体育锻炼情况的差异，Logistic回归模型显示，几乎不喝牛奶或为肾癌的独立危险因素，可使其患病风险增加2.646倍[(95%CI) 为(1.212～5.779)]。

本研究还分析了单倍型与肾癌的相关性，构建了CTLA-4基因2个位点的单倍型。C-G是对照组中最常见的单倍型，在病例组与对照组频率分别为60.8%和74%，这种单倍型与肾癌患病风险降低约0.5倍相关。而在病例组中，T-A单倍型的频率约为19%，而对照组不到10%，此单倍型与患肾癌的风险增加约2.5倍相关。即提示rs5742909C-rs231775G可能是肾癌患病的保护因素[OR(95%CI)为0.556 (0.360～0.858)]，而rs5742909T-rs231775A或为肾癌患病的危险因素[OR(95%CI)为2.230(1.216～4.089)]。

肾癌的发病率在世界范围内呈上升趋势，因此寻找影响肾癌发病风险、进展和疗效的因素至关重要。本研究局限性在于样本量较小，可能没有足够的统计能力探索两者之间的真实关系。数据显示CTLA-4多态性与中国人群肾癌患病风险无关，进一步研究更大的群体规模、多中心的临床研究，结合临床指标，从多角度阐明遗传变异在CTLA-4基因和肾癌中的作用。