HPLC法同时测定草苁蓉中草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B

陈 民 田梦飞 冯昌寅 孟宪明 罗 猛 牟璠松*

（1. 东北林业大学化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040；2. 海南热带海洋学院生态环境学院，三亚 572022）

草苁蓉（Boschniakia rossica（Cham.et Schlecht.）Fedtsch）是一种寄生植物，生长在桤木的根上。草苁蓉也称为“不老草”，分布于中国，印度，日本，韩国和俄罗斯［1～2］。在亚洲，草苁蓉的干燥全草被用作传统中药，作为补肾药，用于增强肾功能和改善勃起功能障碍［3］。

草苁蓉中含有苯丙素苷、环烯醚萜苷、单萜、三萜、生物碱和甾醇等多种成分［4～6］。其中草苁蓉的环烯醚萜苷主要成分为草苁蓉纳拉苷，草苁蓉的苯丙素苷主要成分为草苁蓉苷B。现代药理学研究表明，草苁蓉全草及其有效部位提取物如环烯醚萜苷、苯丙素苷类、多糖等具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤（肺癌、肝癌）、抗氧化（抑制肝匀浆和肝线粒体体脂质过氧化）、清除自由基及抗衰老、减轻肝脏损伤、益智作用（减少脑内神经元凋亡）和抗炎作用等［7～13］。

虽然之前已有文献对草苁蓉指纹图谱进行了绘制，但都没有对特征峰进行鉴定和含量测定［14～16］。本研究采用高效液相色谱梯度洗脱方法，可对两种主要成分进行定量分析，检测方法快速、高效、简便，结果重现性好。

1 材料与方法

1.1 实验材料

草苁蓉（哈尔滨当地药材市场购买）置于60℃恒温干燥箱中干燥至恒重，粉碎，过60 目筛备用。草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷对照品（云南西力生物公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 主要实验设备

美国Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪；电子分析天平（北京赛多利斯天平）；高速多功能粉碎机（CS-2000，武义海纳电器有限公司）；超声波清洗器（洁盟JP-040S）；微孔滤膜（针式过滤器0.45 μm 有机系，Lab Instrument Co.，Ltd.）。

1.3 草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B测定方法

色谱柱：Klimail 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：以乙腈为流动相A，以0.5%甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱条件：0～12 min，15%A；12～30 min，15%～20%A；30～40 min，20%～25%A；40～45min，25%～30% A；45～60 min，30%～100%A，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：260 nm，柱温：30℃，进样量：20 μL。

1.4 溶液制备

1.4.1 供试品溶液的配置

称取干燥草苁蓉全草适量，粉碎，过60 目筛，精密称取1 g 粉末，将其置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇溶液10 mL，密塞称重，超声处理0.5 h后，等待其冷却至室温后，再次称重，用甲醇补足缺少的重量，摇匀，提取物离心，滤过，再用0.45 μm 有机滤膜过滤，作为样品溶液，待用，测定时取20 μL进样。

1.4.2 对照品溶液的配置

精密称取草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 对照品适量，精密称定，置于10 mL 容量瓶中，用色谱级甲醇定容至刻度线，将其摇匀，配置成质量浓度为0.1 mg·mL-1的对照品溶液，摇匀，即得。

1.5 方法学验证

1.5.1 标准曲线的制备

精密量取1.4.2 对照品溶液适量，梯度稀释成6种不同浓度的对照品溶液。按照1.3的色谱条件测定草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 组分的峰面积，记录色谱图，对照品溶液浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，求得各自的回归方程及相关系数R2。

1.5.2 专属性试验

将配制好的草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 对照品混合溶液和供试品溶液各取20 μL，按1.3 色谱条件进行测定，每份样品测3次。

1.5.3 精密度试验

精密量取草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 对照品溶液，按照1.3 色谱条件重复测定6 次。计算6 次进样峰面积的RSD值，考察仪器的精密度。

1.5.4 重复性试验

精密量取供试品溶液，按照1.3 色谱条件重复测定6次。计算6次进样峰面积的RSD 值，考察方法精密度。

1.5.5 稳定性试验

精密量取供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h并按1.3方法进行测定8次。计算不同时间点进样峰面积的RSD 值，考察供试品溶液的稳定性。

1.5.6 检出限与定量限

精密量取对照品适量，以1.4.2 方法配置对照品溶液，逐步稀释，按S/N=10 计算定量限，按S/N=3计算检测限。

1.5.7 回收率试验

精密量取对照品9 份，分别精密加入1.4.2 的对照品溶液1.0、1.5 和2.0 mL，使其相当于含量为80%、100%和120%的样品。每个浓度3 份样品，按1.3 色谱条件测定峰面积，由回归方程计算供试品中草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B的回收率。

2 结果与分析

2.1 线性关系

为了验证新建立的高效液相方法是否符合草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 的常规分析，对草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 制作标准曲线如表1。结果表明，草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 的相关系数（R2）在各自浓度范围内呈良好的线性关系。

表1 各测定成分标准曲线数据Table 1 Standard curve data for each component

2.2 专属性试验

结果如图1所示，两种混合对照品溶液的出峰时间与供试品溶液中两种物质的出峰时间几乎一致。

2.3 精密度试验

表2 中草苁蓉纳拉苷的RSD=0.57%，草苁蓉苷B的RSD=0.73%。这表明该方法正确合理。

表2 各测定成分精密度实验结果Table 2 The experimental results of the precision of each component（n=6）

2.4 重复性试验

2.5 稳定性试验

草苁蓉纳拉苷的RSD=0.29%，草苁蓉苷B 的RSD=0.75%（见表3）。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

表3 各测定成分重复性和稳定性实验结果Table 3 Repeatability and stability test results of each component

2.6 检出限和定量限

经计算，草苁蓉纳拉苷检出限为4.687 5 μg·mL-1，草苁蓉苷B 检出限为3.433 7 μg·mL-1。按信噪比10∶1 测得：草苁蓉纳拉苷定量限为14.205 1 μg·mL-1，草苁蓉苷B 定量限为10.405 4 μg·mL-1。这表明，此分析方法具有较好的灵敏度。

2.7 加样回收试验

通过测定3 种不同浓度的对照品溶液对回收率进行分析。草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 平均回收率分别为97.86%、96.55%，RSD 分别为1.01%、1.23%（n=9），结果见表4～5。实验结果显示回收率良好。

表4 草苁蓉纳拉苷回收率测定结果Table 4 Result of recovery of baschnaloside（n=9）

表5 草苁蓉苷B回收率测定结果Table 5 Result of recovery of rossicaside B（n=9）

3 结论

草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 是草苁蓉主要活性成分，具有抗肝损伤、增强免疫力、抗炎、抗疲劳等多种生物活性。

本研究利用高效液相色谱法建立了同时测定草苁蓉中草苁蓉纳拉苷和草苁蓉苷B 两种组分的方法。方法学的验证结果表明，该方法简便、准确，重现性好，为草苁蓉的进一步开发提供理论基础。