基于ISSR分子标记的孑遗濒危植物四合木遗传结构分析

段义忠 王海涛 张格格 严伟娜

（榆林学院，陕西省陕北生态修复重点实验室，榆林 719000）

四合木（Tetraena mongolica）属蒺藜科（Zygophyllaceae），是古地中海第三纪活化石植物，国家一级保护植物。四合木属于落叶小灌木，双数羽状复叶，花1～2 朵着生于短枝上，成熟果实具有不开裂的分果瓣4 个，其种子形状为镰状披针形，绝大多数果实中只含有一个较小的种子［1］。目前四合木（T.mongolica）在全世界分布区主要集中在中国内蒙古鄂尔多斯、乌海、宁夏石嘴山等地，在俄罗斯、乌克兰也有零星分布，为典型的西鄂尔多斯特有单种属和特有群系，对维持中国西北干旱、半干旱区的生态系统功能及稳定性具有重要意义。四合木具有超强抗旱能力，但近年来由于全球气候变化的加剧以及人类对其分布区域所属地区的煤炭等天然矿产资源的大量开采等对生态环境的干扰［2～3］，使得四合木这一濒危物种所在分布区域生态系统变得非常脆弱且分布面积迅速缩小，其栖息地仅为2 700 km2，且呈现破碎化分布，生境适宜性骤降，濒危状况加剧［4］。

当前国内外针对四合木的研究主要集中在其光和特征及固碳能力［5～6］、保护对策［7］、花粉形态学［8］、种子脂肪酸含量测定及分析［9］、传粉生态学［10］、生理学和濒危肇因与机制等方面［11～12］。依据四合木在异域播种后生长量大小比较及对不同属性土壤和对水、热等综合影响因子的适应性分析得到，相同地区不同土壤间四合木生长量之间不存在差异性，不同地区相同土壤间四合木生长量之间却存在着特别明显的差异性，表明了土壤条件对四合木的生长影响不大，而气候成为直接影响四合木生长的最重要条件；四合木分布区与异地保护区中土壤之间的微量元素具有一定的差异性，但因为土壤中的微量元素含量均低于植物中含量，表明四合木具有对土壤中微量元素的富集作用，土壤中微量元素的含量并不能影响四合木正常生长［13］。张云飞等［14］通过设计了9个10 m×10 m 样方的观察结果，系统地对比了四合木在自然更新、消极围栏保护和积极围栏保护3种不同情况下的种群生长状况，结果表明消极围栏保护对四合木种群的更新换代并无促进作用；而积极进行围栏保护也就是人工围栏并进行适当的补水补肥对四合木种群有很好的保护作用，是就地保护四合木的有效手段。Ge 等［15］对四合木基因的变异、种群结构和谱系地理等方面进行评估，为四合木保护和管理提供依据。张颖娟和卢萍［16］对四合木进行了遗传结构和遗传分化、基因变异性和遗传多样性的研究，提出了应对具有较高遗传多样性的四合木中的meta-种群加强保护。近年来，诸多学者利用等位酶、RAPD和微卫星等方法对四合木的遗传多样性和遗产结构进行了研究［16～18］，但等位酶分析法所选酶的所有基因未必都能表达在酶谱上，且受酶数量影响，数量较少时，其结果可能不具有代表性［19］，而且RAPD 具有对反应条件敏感，重复性差，多态性信息量较低等不足［20］，增加了试验难度和工作量。目前，还未见基于ISSR技术对四合木的遗传多样性和遗传结构的分析研究。

ISSR（Inter-simple sequence repeat）即简单重复序列标记，其基本原理为将1～4 个碱基作引物标定在SSR 的3'或5'端，扩增两侧具有反向排列SSR 的一段序列，而不是扩增SSR 本身［21］。ISSR分子标记技术同时具有多种分子标记的优点，ISSR 成本低且多态性高、可获得几倍于RAPD 的信息量、精确度高、有较高的重复性且相对稳定、简单快捷且更容易操作、更专一。物种经历长时间的进化而具有了丰富的遗传多样性，这对研究物种的生物学特性具有重要意义，通过对物种遗传多样性的研究可以得知该物种的适应性、生存力，进而对其实施科学有效保护措施。ISSR 分子标记技术同时兼具多种分子标记技术的优点，因此该技术得到了各界的肯定并得到了广泛应用［22］。李娟等［23］利用ISSR分子标记对闽楠不同地理种群的遗传多样性进行分析，研究结果为该物种保护策略制定提供有价值的种群遗传学信息。沈奇等［24］采用ISSR 分子标记技术对野生桃儿七13 个居群进行遗传多样性分析，结果表明种群内的基因流十分丰富，居群内的遗传分化明显大于居群间的分化，聚类结果显示桃儿七13 个居群可以分为两大类，研究结果为其品种分类及种质保护提供理论依据。

本试验以中国西北干旱区特有孑遗濒危植物四合木为研究对象，选取鄂尔多斯高原西部6个不同地理分布的四合木种群作作为试验材料，利用ISSR 分子标记技术进行试验，通过分析和探讨其遗传多样性水平及遗传结构，以解释其遗传多样性与不同地区的生境条件关系，为四合木遗传资源的有效保护、管理与利用提供重要参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验所采集的四合木种群材料均来自中国四合木自然栖息地6 个自然种群（见表1），采下嫩叶置于自封袋并放入适量变色硅胶，记录后放于-80℃的超低温冰箱中作为试验材料。

表1 四合木采样地点Table 1 Sampling position of T.mongolica

1.2 DNA的提取及检测

采用三博远志公司提供的DNA提取试剂盒提取，将提取好的DNA 溶液稀释10 倍后，将其保存于-20℃的冷藏环境中备用。将上述试验提取出来的四合木DNA 挑选出一组作为模板，选取30 条UBC引物进行扩增。从中筛选出6个清晰度较好、条带数目多且没有拖尾现象的引物，将以下6 个UBC引物作为下一步扩增的引物（见表2）。

表2 UBC引物序列Table 2 UBS primer sequence

本试验采用了单因素法对25 μL 的PCR 反应体系各项因子进行优化。以UBC 811 和UBC 835为引物，参考相关文献设计了4 个10×Easy Tag buffer梯度：1.5，2.0，2.5和3.0 μL；4个dNTPs梯度：1.6，2.0，2.4 和2.8 μL；4 个Easy Taq DNA 聚合酶梯度：0.10，0.15，0.20 和0.25 μL；DNA（母液稀释10倍）模板设计4 个梯度1，2，3 和4 μL。最后得出PCR 反应体系为：DNA 模板2 μL，UBC 引物1 μL，Taq 聚合酶0.15 μL，dNTP 1.6 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.75 μL。对退火温度、循环次数及延伸时间进行优化后的PCR扩增程序为：①选择94℃预变性5 min；②变性30s 后在42℃～48℃温度下退火30 s；③在72℃温度下延伸3 min，循环32次，再补平7 min；④选择8℃温度下永久保存。

1.3 数据统计与分析

通过人工识别的手段记录四合木66个材料的凝胶电泳图谱条带数目。由于ISSR分子标记是显性标记，所以一个引物的结合位点用电泳图谱中的每个清晰的条带表示。对于同一引物，条带电泳迁移率一致说明是具有同源性的扩增产物。筛选上述凝胶电泳图中易于辨认且较为清晰的条带，将同一位置上是否有DNA 结合位点的条带进行统计。统计的结果以二元数据的形式记录，稳定出现的清晰条带（显性）记作1，没有条带（隐性）记为0，制作“0.l”组成的原始矩阵并记录数据。利用软件Popgene 32 计算“0，1 矩阵”多态位点、多态位点百分率、Nei’s遗传多样性指数（He）、Shannon’s信息指数以及Nei的遗传距离等参数。用分析软件NTSYS-PC对统计结果进行聚类分析，得到四合木种群间的遗传聚类图，以此来研究四合木6个不同地理种群的亲缘关系和遗传多样性。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR扩增结果

本试验利用6个ISSR引物（UBC810，UBC811，UBC814，UBC824，UBC835，UBC873）对6个不同地理种群的66个四合木个体进行ISSR-PCR 扩增，引物UBC811对千里沟、伊克布拉格、甘德尔山、四合木自然保护区、磴口—桃司兔和巴拉贡的24 个个体DNA模板扩增后电泳得到的电泳图（见图1）。

2.2 各个引物扩增产物的多态性

本试验选择用6 个ISSR 引物对6 个不同地理种群的四合木进行ISSR-PCR 扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳共获得370 个清晰的电泳谱带，利用POPGENE 1.31 软件分析四合木各种群的遗传多样性指数［25］。结果显示不同ISSR引物的差异存在于扩增带数量、扩增带型、多态性检出率、条带分布均匀度等多方面。试验所用的6条引物，各自的扩增结果于不同材料间表现出较高的多态性，在一定程度上表明四合木遗传背景的复杂性与丰富的遗传多样性。四合木的各引物扩增多态性结果参照ISSR引物扩增结果（见表3）。

2.3 蒙古沙冬青不同地理种群的遗传多样性

用Popgene 32 软件计算四合木各种群的各项相关指数［26］。计算结果参照四合木遗传多样性（见表4），不同种群的四合木平均多态位点数为23，Nei’s 多样性指数（He）为0.286 5～0.350 8，Shannon’s 信息指数（I）为0.423 6～0.504 9，其四合木自然保护区的Nei’s多样性指数和Shannon’s信息指数均为6个地理种群中最高，而磴口桃司兔的Nei’s 多 样 性 指 数 和Shannon’s 信 息 指 数 均 为最低。

表3 ISSR引物扩增结果Table 3 ISSR primer amplification results

2.4 四合木不同地理种群遗传多样性及遗传距离分析

利用软件Popgene 32 软件计算四合木不同地理种群的遗传分化系数（Gst）为0.125 3，表明群体间存在一定程度的遗传分化；种群内遗传多样性（Hs）为0.316 7，表明四合木的遗传分化主要发生在种群内；6 个种群的基因流（Nm）为3.491 5＞1，表明四合木6个种群间具有一定的基因流，可以防止遗传漂变所导致的遗传分化。由四合木种群间的遗传距离结果可知，伊克布拉格种群（YKBLG）和巴拉贡种群（BLG）的遗传距离最小为0.025 9，而四合木千里沟种群（QLG）和甘德尔山种群（GDES）遗传距离最大为0.974 4（见表5）。

2.5 四合木不同种群聚类分析

用NTSYS.pc 2.10e 软件构建了四合木6 个种群的聚类分析图（见图2），6 个种群聚类结果被聚为三大类，千里沟种群、伊克布拉格种群和巴拉贡种群先聚成第一大类，再与磴口—桃司兔种群聚成第二大类，而种群四合木自然保护区种群和种群甘德尔山种群则组成第三大类。

表4 基于ISSR标记的四合木遗传多样性Table 4 Genetic diversity of T.mongolica based on ISSR marker

表5 四合木种群间的遗传距离Table 5 Genetic distance between T.monglica populations

3 讨论

遗传多样性一般指物种种内的遗传多样性，即同一物种不同群体间或是同一种群内的不同个体的遗传变异总和。一个物种的遗传多样性与其适应环境变化的能力呈正相关，遗传多样性越高其对环境的适应能力越强［27］。四合木作为一种特有建群植物，其长期处在土壤贫瘠、气候干燥的恶劣环境中且不断繁衍、进化，因此展现出丰富的遗传多样性。6 个地理种群中，Nei’s 多样性指数（He）、Shannon’s信息指数（I）最高的均是四合木自然保护区种群，该地区年均温度相对其他几个地区偏高，且满足四合木生长所需要的水分，这些条件是导致四合木具有丰富的遗传多样性的基础，而桃司兔因其特殊的地理位置，相对较低的温度和相对湿润的气候，使得该地区四合木种群的遗传多样性较低。和其余种群相比，四合木自然保护区种群的遗传多样性更显著，对其周边的四合木种群应首先加强保护，但是只保护该地区的四合木种群对四合木整体的遗传多样性的保护是不利的，所以应当制定合适的迁地保护策略。基因流即生物种群之间的基因交流，当某一物种的基因流大于5.0 时，说明该物种具有较高的异交率，而当基因流（Nm）小于l时，遗传漂变导致了种群间的遗传分化。植物种群内和种群间的基因流主要依赖于孢子、花粉、种子、植株个体以及其他携有遗传物质的物体等媒介进行，花粉传播和种子扩散是自然植物种群最主要的基因流的方式［18］。适当的基因流不但可以维持种群的稳定性，而且在一定程度上可以提高它们对不断变化的环境适应能力。四合木基因流Nm为3.491 5，Nm＞1.0，说明四合木种群间基因流水平较高。四合木6 个种群的平均遗传距离为0.139 3，说明四合木种群之间的遗传分化程度较小。通过四合木种群间的聚类图可知聚类结果分为三类，种群千里沟、伊克布拉格和巴拉贡先聚成一大类，再与甘德尔山聚成第二大类，而四合木自然保护区和桃司兔则组成第三大类。这说明距离因素是影响四合木种群间遗传分化的主要原因，但不同生境条件也对四合木种群的遗传分化产生了影响，桃司兔与千里沟、伊克布拉格和巴拉贡因距离较近，但也产生了一定的遗传分化，主要原因是因为桃司兔的生境条件为黄河河滩生境，相对湿度较大；而千里沟、伊克布拉格和巴拉贡为荒漠草原生境，相对湿度较小，生境的差异导致了桃司兔种群与另外的三个种群产生了遗传差异。因此，本研究的结果对于进一步研究四合木的遗传分化是否与地理因素相关具有一定的参考意义。张颖娟等［28］利用等位酶和RAPD分析技术对海南区、桃司图、乌加庙、石嘴山和千里山的四合木种群进行遗传距离分析结果表明，乌加庙种群与其他4 个种群的遗传距离都较大，并认为是生境的选择压力所导致而与距离因素无关，与本研究的结果不一致，主要原因可能是RAPD 与ISSR 算法原理上的不同，虽然ISSR 与RAPD 两种研究方法在一定程度上都能反映四合木的遗传多样性较高，但RAPD 在方法上有一定缺陷，而ISSR多态性、精确度和重复性都较高，

通过对四合木6 个不同地理种群进行研究得出如下结论：①本试验共筛选出6 条ISSR 引物获得多样性丰富、清晰的条带共370 个，其中261 个条带具有多态性，占总条带数的71%，6 个地理种群中四合木自然保护区种群的Nei’s多样性指数、Shannon’s 信息指数均为最高，而磴口—桃司兔的则为最低。以上结果表明本试验的四合木遗传多样性水平较高，且本研究所采集的66 个样本分布范围较广，生态环境差异较大，其所处植物群落结构差异较大，所以具有丰富的遗传多样性。②通过对四合木6个种群的基因分化系数（Gst）分析，表明种群内遗传多样性变异的百分率为81.81%，说明种群内变异是四合木的遗传变异主要来源。种群内遗传多样性（Hs）为0.316 7，说明四合木的遗传分化主要发生在种群内。6 个种群的基因流（Nm）为3.491 5＞1，表明6 个种群间具有一定的基因流，可以防止遗传漂变所导致的遗传分化。四合木的6 个种群的遗传距离平均值为0.139 3，伊克布拉格种群和巴拉贡种群的遗传距离最小为0.025 9，而千里沟种群和甘德尔山种群遗传距离最大为0.974 4。由四合木种群间的聚类图得知聚类结果分为三类：千里沟种群、伊克布拉格种群和巴拉贡种群先聚成一大类，再与磴口—桃司兔种群聚成第二大类，而四合木自然保护区种群和甘德尔山种群则组成第三大类。这说明距离因素是影响四合木种群间遗传分化的主要原因，但不同生境条件也对四合木种群的遗传分化产生了影响。