野生玫瑰果实发育过程中种子的细胞组织结构和内源激素变化对其休眠性的影响

王思涵 杨 涛 张金柱 董 婕 寇志玲 车代弟

（东北农业大学，哈尔滨 150030）

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）的落叶灌木，品种繁多，香气馥郁，是园林绿化和水土保持的优良植物材料［1］。玫瑰花果硕大饱满，颜色鲜艳且产量高［2］，是重要的观花和观果花卉，具有很高的观赏价值。玫瑰抗寒、抗病、耐干旱瘠薄，作为重要的防风固沙植物栖息在滨海沿岸，不仅是蔷薇属花卉栽培繁育的重要种质资源，还对于保持生态环境的稳定具有重大作用［3］。20 世纪80 年代，由于资源过度的开发利用以及其本身种子品质差及后熟的特性，野生玫瑰在中国的分布区逐渐缩小甚至出现了片断化现象。1992 年，野生玫瑰作为国家二级保护植物被编入进《中国植物红皮书——稀有濒危植物（第一册）》中［4］。

吉林珲春分布区是国内目前唯一野生玫瑰天然群落保存尚好的区域，其自然繁育以无性繁殖为主，种子萌发率低，传播力弱。Anderson 研究指出野生玫瑰的成熟种胚被木质坚硬的果皮包裹并保护［5］，其果皮的硬度和厚度是阻碍玫瑰种子发芽的主要障碍之一［6］。2015 年De Vries 研究发现蔷薇属植物成熟瘦果的果皮成熟初期含有高浓度的脱落酸，也阻止种子的直接萌发，致使新收获的玫瑰种子便具有深度休眠的特性，严重制约着玫瑰资源的保护与利用［7］。然而，种子的休眠特性与果实的成熟过程密不可分［8］。Dubois［7］认为果实成熟过程中颜色的变化可能指示种子休眠的深度。曾有育种者建议在玫瑰果实着色前提取瘦果，可以促进早期发芽，并且认为果实成熟的最后30 d种子才具有休眠状态，然而这一系列猜想尚未有研究数据及成果支持。因此，本研究通过对野生玫瑰果实成熟过程中种子生长发育情况及种子内源激素含量变化的掌握，探究果实发育过程中种子休眠性的变化，对野生玫瑰资源的保护利用及玫瑰的生产栽培管理具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为吉林省珲春市自然群落中的野生玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）。从2019 年7 月开始，从玫瑰开花当天开始挂牌，于花后每隔1～3 d，随机取生长势相近的玫瑰果实3～5 个，装于冰盒内带回实验室进行测定，直至果实成熟时结束。果实成熟标志为：果实完全着为均匀的红色，成扁圆形且富有光泽。

1.2 试验方法

1.2.1 野生玫瑰果实及种子生长时期的确定

随机选取3～5 个发育状态良好、大小相近的玫瑰果实进行形态学观察并拍照。每次取样后用游标卡尺对果实的纵径、横径进行测量。剥开果实取出100粒种子，使用游标卡尺测量种子的最大长度、宽度，用千分之一天平测量种子的千粒重，3次重复。

1.2.2 种子发育的胚胎学观察

参照高营营的石蜡切片制作方法［9］，种子采收后迅速放入FAA 固定液（70%酒精∶冰乙酸∶甲醛=90∶5∶5）中固定，以梯度乙醇溶液（70%，85%，95%）脱水后浸蜡包埋。将包埋好的蜡块切成蜡带置于载玻片上，并在37℃烘片机上展片。切片干燥脱蜡后，经番红与固绿染色，最后利用中性树胶封片固定。制成的切片置于显微镜下观察。

1.2.3 野生玫瑰果实发育过程中内果皮硬化观察

玫瑰内果皮质地较硬，木质化程度较高，通过间苯三酚法对木质素染色，可以直观地反映其内果皮硬化的程度。本试验选取玫瑰果实发育过程中的3 个时间点：花后24 d（青果期种胚发育完全）、花后50 d（转色期）、花后75 d（红果期）果实和种子进行染色，染色方法参照韩国粉的制作方法［10］，染色反应结束后将种子取出观察并拍照记录。

1.2.4 种子内源激素含量变化测定

试验材料选取不同发育时期的玫瑰果实，剥开后称取质量为0.3 g的玫瑰鲜种子置于液氮中保存，3次重复。GA3，IAA和ABA的提取及含量测定参考谢莹（2014年）的方法［11］。

色谱条件：色谱柱采用Symmetry®C18 色谱柱，流动相为甲醇∶乙腈∶0.7%冰乙酸溶液=50∶5∶45 v/v/v，柱温：25℃，流速：0.8 mL·min-1，紫外检测波长：260 nm，进样量：20 μL。采取外标工作曲线法定量。

1.3 数据分析

试验测得数据采用Excel 2007进行整理，并用Graphpad Primer 软件获得相关的折线图或柱状图，应用SPSS 20对数据进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 野生玫瑰果实不同发育时期果实及种子质量的变化

玫瑰的开花期为每年的7～9 月底，果期为8～10月。玫瑰开花后，受精的子房逐渐发育成瘦果，胚珠发育成种子。根据玫瑰果实发育不同时期的质量指标变化（见图1A），可以看出，果实的生长过程可划分为3 个时期，分别为青果期、转色期和红果期，其中青果期（1～35 d）也为果实的第Ⅰ速长期，其直径和横径的增长较快，净增长量占成熟时的53.88%和53.82%，此时果实成圆形，颜色为青绿色，果形指数为0.916±0.113；转色期（35～60 d），也为果实的缓慢生长期，由于内果皮的木质化，玫瑰果实的直径和横径增长缓慢，果实颜色由青绿色逐渐转变为橙红色；红果期（60～75 d），即第Ⅱ快速生长期，由于果实细胞的迅速膨大和后期营养物质的积累，果实的直径和横径增长速度变快，果实横径大于纵径，果实呈扁球形，果形指数为0.771±0.052。果实发育成熟后颜色也转变为橙红色。

不同发育阶段的果实内种子的大小及千粒重变化也有很大的不同。如图1B～C 所示，在青果期（1～24 d）种子千粒重迅速增加，此时种子横径与直径也不断增长，说明种子发育较快，不断膨大并富含水分。种子千粒重在24 d 达到顶峰，但种子体积还在不断变大，说明24 d 时内果皮开始木质化逐渐失去水分，但种子内含物还在积累，体积还在膨胀。在果实转色期和红果期种子横纵径不断减小，千粒重也随着果实的发育不断变轻，伴随着内果皮木质化的完成最终于75 d 时种子形态基本不再发生改变。

2.2 野生玫瑰果实不同发育时期果实与种子外部形态及胚胎发育的变化

如图2可知，种子的胚胎发育是在青果期完成的。花后1 d 即形成合子，此时种子为透明的黄色。花后3 d，内果皮颜色变为半透明的黄色，富含水分，此时合子开始启动分裂，形成多细胞原胚。花后6 d，种子体积持续增长，多细胞原胚持续分裂形成球形胚。花后12 d 时球形胚持续分裂，逐渐形成突起，当球形胚体积增大和原表皮明显出现后，周围区的细胞分裂更加活跃，细胞分裂分布的变化预示着心形胚将开始。花后15 d，种子颜色变为不透明的黄色，体积不断增大。球形胚在顶端形成两个突起的子叶原基，形成心形胚。心形胚发育时期，子叶将形成的区域细胞分裂增多，由于细胞分裂的不一致性和细胞的扩大，胚在下胚轴区域会开始伸张而形成鱼雷形。花后24 d，种子体积持续增大，质地变硬，此时种胚已发育成完整的子叶胚。由于内果皮木质素的沉积，此时已难以形成完整切片。花后30～75 d，内果皮开始变不透明黄色，最终硬化变成黄色的成熟种子。

2.3 野生玫瑰果实不同发育时期内果皮发育及木质素沉积的变化

2.3.1 不同发育时期内果皮细胞结构变化

玫瑰花后第6 天的果实内果皮由7～9 层厚壁细胞组成，细胞小而密集且排列紧密，无明显的胞间隙，与中果皮界线明显（见图3A～B）。果实发育到第15 天时内果皮细胞分裂分化迅速，数目不断增多，大部分细胞呈现扁平状，纵向延长。外侧1～2层细胞呈方形紧密排列，内侧细胞均呈扁平状紧密排列（见图3C～D）。果实发育成熟后，内果皮细胞细胞壁逐渐加厚，木质化严重。最外侧的1～2层细胞开始增厚，形成了木质化的石细胞层，逐渐形成坚硬的种壳，石细胞层以内的内果皮细胞排列非常致密，几乎无法用石蜡切片法进行切片观察（见图3F）。

2.3.2 不同发育时期内果皮木质素沉积情况

图4 显示出了不同发育时期玫瑰果实和种子染色后体视显微镜下观察的外观特点。青果期时，果实内导管组织含有一定木质素，但此时内果皮只发生了轻微染色，说明此时内果皮中只有少量的木质素沉积。果实转色期时，肉眼已可看到内果皮木质化，且染色部位明显扩大，染色程度加深。果实成熟期，内果皮已完全被染成深红色，染色范围进一步扩大。

2.4 野生玫瑰果实发育过程中种子内源激素含量的变化

2.4.1 玫瑰果实发育期种子内源ABA 的含量变化

如图5A 所示，种子内源ABA 含量随着果实的发育呈下降趋势。种子内源ABA含量在青果期时最高，达到196.85 μg·g-1。到转色期则有一个明显的下降，降幅达62.76%。转色期和红果期果实内种子ABA含量基本持平。

2.4.2 玫瑰果实发育期种子内源GA3含量变化

种子内源GA3特征是含量高，变化大，整体呈下降趋势（如图5B）。青果期时种子快速发育，此时赤霉素含量最高，为10 522.9 μg·g-1。到了转色期，赤霉素含量稍有下降。转色期到红果期种子内源赤霉素含量急速下降，由9 364.03 μg·g-1下降为2 878.47 μg·g-1，降幅为69.26%。玫瑰种子发育过程中GA3含量的高峰出现在青果期，即种胚发育成熟期。说明GA3和种胚的生长存在密切的相关现象。

2.4.3 玫瑰果实发育期种子内源IAA含量变化

种子内源IAA 含量随着果实的发育呈先上升后下降的趋势。青果期时种子内源IAA 含量较其他激素处于较低的水平，后随着果实的发育整体呈现上升的变化趋势。青果期至转色期时，种子内源IAA 含量变化幅度较大，由5.567 μg·g-1迅速升至32.879 μg·g-1，增幅高达83.07%。转色期到红果期IAA含量又下降至20.457 μg·g-1。

3 讨论

3.1 野生玫瑰果实发育和种子发育的相关性

果实是种子在母株上的载体，种子会随着果实的发育逐渐进行胚分化及胚乳和种皮的形成，因此种子的形态、营养物质的积累及内源激素的调控都与果实的发育存在联系和相互作用［12］。刘平［2］对8 个玫瑰品种的果实生长动态研究发现，野生类型果实横径生长中有两个生长较快时期，纵径增长趋势大体一致。本试验将果实的生长发育期分为青果期（1～35 d）、转色期（35～60 d）、红果期（60～75 d）三个时期，生长速度呈现“快—慢—快”的变化趋势。青果期时种子含水量最高，外观形态不断膨大，重量迅速提升。转色期果实内果皮木质化脱水，种子外表面颜色加深，种子体积变小，千粒重开始变轻。红果期种子形态已基本保持稳定。研究结果与油茶果实及种子的生长动态相类似［13］。

有研究认为玫瑰中花粉管到达子房所需的时间估计在授粉后12～24 h，且发育速度快［14］。2017年付长丽［15］通过內源激素含量证明牟平玫瑰种胚在授粉60 d 已经发育成熟，但该结果未结合胚胎学观察，因此范围较广，不能确定最初成熟的时间。本试验结合石蜡切片技术观察到玫瑰花后1 d形成合子，花后3 d 发育为多细胞原胚，花后24 d玫瑰种胚发育完全，结果与Luca Pipino 认为多花玫瑰种胚30 d 发育完全的试验结果相类似［8］。本试验结果证明了野生玫瑰种子在果实的青果期便已发育完全，具有完整的胚结构，即野生玫瑰种子不存在形态休眠。

3.2 野生玫瑰种子组织结构发育对其休眠性形成的影响

内果皮具有重要的作用价值，它对种胚起到天然的保护作用［16］。内果皮细胞的发育是一个逐渐木质化的过程［17～18］，然而木质化严重的内果皮会制约玫瑰种子的繁殖能力，有性繁殖能力差成为野生玫瑰资源衰减的重要原因之一。研究结果证明，内果皮开始硬化的时间为24 d，此时种胚已发育完全，内果皮细胞壁逐渐加厚并失水皱缩，种子千粒重开始下降，间苯三酚染色观察到此时已有少量木质素沉积。果实转色期（35～60 d）时，种子质量变小，内果皮木质化程度持续加深。到了红果期（60～75 d）时内果皮基本已完全木质化，种子外观形成了一层厚重的“壳”，结构致密难以剥离，此时内果皮对种子的萌发起到了严重的阻碍作用，种子已进入机械休眠［19］。

3.3 野生玫瑰果实发育中种子内源激素的变化对其休眠性形成的影响

张妮妮认为不同的果实成熟度对玫瑰种子萌发影响较大［20］。而果实的成熟与激素含量变化有关，其生长依赖于发育正常的种子，种子又是激素合成的主要场所［21］。通常，种子内产生植物激素向外扩散，刺激周围组织生长，并调控着果实的发育周期［22］。2020 年高美玲［23］研究发现高浓度的ABA 在西瓜种子生长过程中起到促进发育的作用。本试验中，ABA 对种子的调控高峰在果实的青果期，此时果实发育迅速，生长力旺盛，ABA 的浓度最高，这也与樊卫国［24］发现在刺梨种子发育前期，高浓度的ABA 与促进代谢和细胞分裂有关的结论一致。种子内源ABA含量与果实颜色转化密切相关［25］。研究认为，果实转色期前内源ABA含量较高，进入转色期后，为了利于果肉内番茄红素和β-胡萝卜素的积累，ABA 含量迅速下降［26］。本试验也得到了相似的实验结果，即果实转色期种子內源ABA 含量降低，降幅高达62.76%。种子内高浓度的脱落酸含量似乎是玫瑰种子生理休眠的主要原因。

果实成熟前种子内赤霉素含量的上升与胚发育相关［27］。付长丽［15］研究发现授粉30 d 后的玫瑰种胚中的GA3含量随着发育时间逐渐降低。本研究结果与其相一致，并观察了种胚形成期的赤霉素浓度。在本研究中，青果期（1～35 d）果实内种胚正处于发育时期，细胞不断分裂分化形成成熟胚，此时种子内源GA3含量最高，随着果实生长速度变缓，种子发育完全成熟，进入转色期和红果期GA3合成能力下降，含量减少。

种子内IAA 含量在果实青果期到转色期有显著变化，此时正是内果皮逐渐木质化的过程，而木质素的沉积与激素含量之间具有密切的关系［28～29］。Biale 研究认为果实的成熟与IAA 密不可分，一些果实内源IAA 必须先经氧化，使其浓度降低后果实才能完熟［30］。本研究发现，青果期到转色期时种子内源IAA 含量增加。转色期到红果期，种子中IAA 含量又开始降低直至果实完全成熟。由此推断内果皮发育及果实的成熟与生长素间存在一定的关系，而生长素是如何调控或影响其发育过程的，目前还没有直接的试验证据，需要进一步深入的研究。

本文通过形态学、组织细胞学观察及高效液相色谱技术对果实发育期种子休眠性的形成及变化进行了评价，并结合试验数据得出结论：玫瑰果实发育过程中种胚发育完全，种子不具有形态休眠。种胚发育完全后内果皮形成木质素逐渐木质化，使得种胚受到机械束缚产生种壳休眠。果实发育过程中种子体内高浓度的ABA含量使得种子尚未脱离果实时便已进入了生理休眠状态。证明了尚未脱离果实的玫瑰种子具有生理休眠和种壳休眠两种复杂的休眠性状，这为日后深入探索玫瑰种子发育及休眠的分子调控机理提供数据信息。