表皮生长因子受体、自噬相关蛋白5、p62蛋白在甲状腺乳头状癌合并颈部淋巴结转移中的表达及临床意义

吴彬，陶娟，佟萌，聂琛

大连大学附属中山医院乳腺甲状腺外科，辽宁 大连 116001

甲状腺乳头状癌（papillary carcinoma of thyroid，PTC）是甲状腺癌的高发类型，约占甲状腺癌的85%，但其发病机制目前仍未完全明确。尽管PTC的诊疗手段不断发展，但由于PTC患者易发生淋巴结转移，预后依然很差。自噬是细胞适应内外部环境变化的能动过程，细胞内部分胞质、蛋白质和变性坏死的细胞器与自噬泡中的溶酶体融合形成自噬溶酶体，并降解产生氨基酸、核苷酸供细胞再利用的循环过程，也被称为Ⅱ型程序性死亡，属于细胞正常的功能，这一功能在进化过程中高度保守。研究表明，自噬在肿瘤细胞生长、发育、成熟及死亡过程发挥着不同的作用。研究显示，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）与肿瘤细胞的发生、发展密切相关，在多种实体肿瘤中呈异常高表达，此外，EGFR通过调节多条信号转导通路参与细胞的自噬过程。目前，自噬与EGFR是否相互作用共同促进甲状PTC合并颈部淋巴结转移的发展尚不清楚，因此，本研究探讨EGFR和自噬相关蛋白5（autophagy related protein 5，ATG5）、p62蛋白在PTC组织和颈部转移淋巴结中的表达，并探讨其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年3月至2015年2月大连大学附属中山医院收治的PTC患者。纳入标准：均经病理学检查确诊为PTC；术前均未进行放化疗和其他治疗；3年随访资料完整。排除合并其他肿瘤的患者。依据纳入和排除标准，本研究共纳入80例PTC患者，男28例，女52例；年龄40～79岁，平均（48.32±12.23）岁；＜45岁32例，≥45岁48例；按照2009版国际抗癌联盟TNM分期标准：I～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期41例；肿瘤直径：＜1 cm 35例，≥1 cm 45例；分化程度：高分化26例，中分化32例，低分化22例；淋巴结转移45例，无淋巴结转移35例。取80例PTC患者的PTC组织及相应的癌旁正常组织，同时取其中合并颈部淋巴结转移的45例患者的转移淋巴结组织标本，所有组织标本10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，用于后续实验。

1.2 实验方法

1.2.1 主要抗体和试剂 兔抗人EGFR多克隆抗体、兔抗人ATG5单克隆抗体，p62单克隆抗体均购自北京奥维亚生物技术有限公司，链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）试剂盒购自美国Abcam公司，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化法检测EGFR、ATG5和p62蛋白的表达情况 石蜡切片，置于40%乙醇中40℃水浴4 min，置于60℃烘箱中烘片，二甲苯脱蜡20 min，梯度乙醇水化，加入3% HO，室温10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性。对EGFR、ATG5、p62蛋白进行高温高压组织修复，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗，加入5%羊血孵育30 min。除去封闭液，加入一抗，4℃冰箱过夜，PBS代替一抗作为阴性对照，次日取出PBS冲洗；滴加二抗，室温下孵育30 min，PBS冲洗5次，每次3 min。DAB显色，PBS冲洗终止显色，然后水冲洗，盐酸乙醇分化，乙醇脱水干燥，光学显微镜下进行观察。

1.2.3 判定标准 光学显微镜下观察制备好的切片，阳性为细胞质内呈棕黄色颗粒，由两名病理科医师独立进行评估，每张切片随机选取5个高倍镜视野（×400），通过染色强度和阳性细胞所占比例进行评估。染色强度：无着色计0分，淡黄色染色计1分，棕黄或棕褐色染色计2分。阳性细胞所占比例：无阳性细胞计0分，阳性细胞所占比例＜25%计1分，阳性细胞所占比例25%～50%计2分，阳性细胞所占比例51%～75%计3分，阳性细胞所占比例＞75%计4分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相乘，＞3分判定为阳性，≤3分判定为阴性。

1.3 随访方法

PTC患者均以电话、门诊等方式多所有患者进行为期3年的随访，随访截止时间为2018年2月，总生存时间（overall survival，OS）为从手术至随访结束或死亡时间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对所有数据进行统计学分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ检验；相关性分析采用Spearman相关分析；采用Graphpad prism 5软件绘制生存曲线，生存率的比较采用Log-rank检验，PTC患者预后情况的影响因素采用Cox风险比例回归模型分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR、ATG5、p62蛋白表达情况的比较

PTC组织和转移淋巴结组织中EGFR、p62蛋白的阳性表达率均高于癌旁正常组织，ATG5蛋白的阳性表达率均低于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.05），但PTC组织与转移淋巴结组织中EGFR、ATG5、p62蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。（表1）

表1 不同组织中EGFR、ATG5、p62蛋白阳性表达率的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征PTC患者PTC组织中EGFR、ATG5、p62蛋白阳性表达率的比较

不同性别、年龄、肿瘤直径、分化程度PTC患者PTC组织中ATG5蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）；不同TNM分期和淋巴结转移情况PTC患者PTC组织中ATG5蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

χ

=9.756、6.318，

P

＜0.05）。不同性别、年龄和肿瘤直径PTC患者PTC组织中p62蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）；不同分化程度、TNM分期和淋巴结转移情况PTC患者PTC组织中p62蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

χ

=7.166、6.983、4.876，

P

＜0.05）。不同性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、TNM分期和淋巴结转移情况PTC患者PTC组织中EGFR蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征PTC患者PTC组织中EGFR、ATG5、p62蛋白阳性表达率的比较（n=80）

2.3 EGFR、ATG5、p62蛋白表达的相关性分析

Spearman相关分析结果显示，PTC组织中，EGFR的表达与ATG5、p62无明显相关性（

r

=0.042、0.116，

P

＞0.05），ATG5的表达与p62呈负相关（

r

=-0.656，

P

＜0.01）；在转移淋巴结组织中，EGFR的表达与ATG5、p62无明显相关性（

r

=0.071、0.136，

P

＞0.05）；ATG5的表达与p62呈负相关（

r

=-0.562，

P

＜0.01）。

2.4 PTC组织中EGFR、ATG5、p62蛋白的表达对PTC患者预后的影响

对80例PTC患者进行为期3年的随访，病死22例，3年生存率为72.50%（58/80）。p62阳性表达PTC患者的3年生存率为65.52%（38/58），低于阴性表达患者的90.91%（20/22），差异有统计学意义（

χ

=5.158，

P

=0.023）；EGFR和ATG5阳性表达PTC患者的3年生存率分别为67.69%（44/65）、94.12%（16/17），与EGFR和ATG5阴性表达患者的93.33%（14/15）、66.67%（42/63）比较，差异均无统计学意义（

χ

=2.836、3.777，

P

＞0.05）。

2.5 PTC 患者预后影响因素的Cox 风险比例回归模型分析

将TNM分期、淋巴结转移情况、EGFR表达情况、ATG5表达情况和p62表达情况作为自变量，以患者的预后作为因变量，纳入Cox风险比例回归模型，结果显示，TNM分期、淋巴结转移、EGFR阳性表达、p62阳性表达为PTC患者预后的独立危险因素（

P

＜0.05），ATG5阳性表达为PTC患者预后的独立保护因素（

P

＜0.05）。（表3）

表3 PTC患者预后影响因素的Cox风险比例回归模型分析

3 讨论

PTC是甲状腺恶性肿瘤中最为常见的类型，好发于中青年女性，且容易较早发生淋巴结转移，严重威胁患者的生命安全。研究表明，多个癌基因及抑癌基因参与了PTC的发生发展过程，深入探讨相关蛋白的表达有利于进一步明确肿瘤的发病机制，同时可提高临床分子诊断的准确性，有助于改善患者的预后。

细胞死亡根据形态学表型不同分为I、Ⅱ、和Ⅲ共3种类型，分别指凋亡、自噬性细胞死亡和细胞坏死。自噬广泛存在于细胞的生理活动中，正常细胞通过自噬可以清除细胞内废物，维持细胞内环境及基因组的稳定，同时也是一种细胞对抗营养缺乏、电离辐射等不良环境的防御机制，在抑制炎性反应或肿瘤的生长过程中发挥重要作用。但有研究表明，自噬活性受损伤后可促进细胞病变和肿瘤的进展。微环境决定了自噬在肿瘤发展中的作用，肿瘤细胞中自噬相关蛋白可出现异常表达，其异常表达成为研究肿瘤发生及抑制肿瘤发展的热点。

ATG5位于人类染色体6q21，编码276个氨基酸，在自噬相关基因ATG严格调控自噬的过程中发挥关键作用，ATG5首先与ATG12结合，形成的ATG5-ATG12泛素样连接系统连接到外膜，自噬体膜延伸，进而形成自噬体，巨噬细胞因缺乏ATG5导致吞噬体不能与溶酶体相互融合。有研究表明，ATG5参与多种肿瘤的发生发展过程，其中胃癌、结肠癌和卵巢癌组织中因ATG5基因突变降低相应蛋白表达量。本研究发现，PTC组织及转移的淋巴结组织中ATG5的阳性表达率低于癌旁正常组织，推测ATG5也可能参与了PTC的发生发展过程。TNM分期、淋巴结转移是评估PTC恶性程度的重要指标，本研究结果显示，不同TNM分期和淋巴结转移情况PTC患者PTC组织中ATG5蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示ATG5阴性表达和PTC的生物学行为可能有关，进一步生存分析结果显示，不同ATG5表达患者3年生存率无明显差异，而Cox风险比例回归模型结果显示，ATG5阳性表达是PTC患者预后的保护因素，说明ATG5阳性表达与PTC患者预后存在一定关系，但只检测ATG5不能很好的反映患者的预后情况。

p62是一种自噬底物连接蛋白，具有多个结构域，可与泛素化修饰的待降解蛋白结合并将其运输至自噬泡中降解。细胞质中p62在正常细胞自噬过程中不断被降解，而自噬功能出现缺陷或失活后，会导致p62蛋白在细胞质中累积，因此，p62可以作为反映细胞自噬活性的标志性蛋白。研究表明，p62浓度增加会促进活性氧的累积，进而导致细胞内质网发生应激反应和DNA损伤，此外，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路及下游基因的表达也会受到p62积累的影响而上调促肿瘤炎性反应。通过自噬降低细胞内p62的水平是抑制肿瘤形成的机制之一。Beclin 1是在哺乳动物中第一个被发现的调节自噬过程的抑癌基因，而p62可使Beclin 1蛋白和B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）分离，释放出Beclin 1蛋白而促进自噬活性。本研究发现，PTC组织及转移淋巴结组织中p62蛋白的阳性表达率均高于癌旁正常组织，表明p62可能参与了PTC的发生发展过程。进一步分析显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期和分化程度为低分化的PTC患者PTC组织中p62蛋白阳性表达率高于TNM分期为I～Ⅱ期和分化程度为高分化的患者，说明p62阳性表达能够间接反映PTC的恶性生物学行为。相关性分析结果显示，PTC组织及转移淋巴结组织中p62的表达与ATG5呈负相关，提示二者之间存在一定的联系，可能是因为肿瘤组织中内环境发生改变后影响了指标之间的相互表达。随访结果显示，p62阳性表达PTC患者的3年生存率为65.52%，低于阴性表达患者的90.91%，Cox分析结果显示，p62阳性表达可作为评估PTC患者预后的独立危险因素。

EGFR是由原癌基因表达，与其配体表皮生长因子、转化生长因子结合后导致细胞内酪氨酸残基发生磷酸化，通过多个信号通路影响细胞生长和凋亡过程，此外，EGFR酪氨酸激酶能够使Beclin 1磷酸化而抑制自噬活性，EGFR还可根据其具有的激酶非依赖活性促进细胞存活。研究表明，EGFR在多种实体瘤中均呈高表达。本研究结果与之类似，PTC组织和转移淋巴结组织中EGFR阳性表达率均高于癌旁正常组织，表明EGFR与PTC的发生发展关系密切；进一步结果显示，EGFR的表达与PTC患者的临床特征和3年生存率均无关。邬琳和郭金珠的研究发现，EGFR与宫颈癌患者临床特征均无明显相关性，与本研究结果类似，但也可能与纳入的临床样本量较少有关。本研究发现，EGFR表达与自噬相关蛋白ATG5和p62无相关性，这可能因为自噬的调节与EGFR磷酸化水平有关，而总EGFR蛋白表达水平不能反映磷酸化程度从而与自噬相关性不显著。但本研究发现，EGFR也可作为PTC患者预后的独立预测因素。

综上所述，PTC组织及淋巴结转移组织中EGFR、p62的阳性表达率较高，ATG5的阳性表达率较低，三者可作为PTC患者预后的独立预测因素，此外，ATG5和p62与PTC生物学行为有关，可能成为PTC诊断的潜在指标。