PTEN基因突变、mRNA表达与卵巢癌病理生物学特征的相关性探讨

刘爽

【摘要】 目的：探討第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（PTEN）基因突变、mRNA表达与卵巢癌病理生物学特征的相关性。方法：选择2018年1月-2020年2月本院62例卵巢癌患者作为观察组，另选择同期于本院治疗的48例卵巢良性肿瘤患者作为对照组。对照组术中取病灶组织，观察组术中取卵巢癌组织与癌旁组织。采用PCR-SSCP完成观察组基因突变检测;采用实时荧光PCR法测定不同组织中PTEN mRNA水平;分析PTEN mRNA水平与卵巢癌病理生物学特征的相关性。结果：卵巢癌组织PTEN基因突变分析结果显示，外显子5第5位密码子T突变为C，经Blast P比较发现氨基酸由丝氨酸（S）变为苯丙氨酸（F）。观察组中卵巢癌组织PTEN mRNA水平低于癌旁组织和对照组中浆液性囊腺瘤与黏液性囊腺瘤组织（P<0.05）。不同年龄、组织学类型及组织分级的卵巢癌患者PTEN mRNA水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;不同FIGO分期、有无淋巴结转移的卵巢癌患者PTEN mRNA水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。PTEN mRNA水平与FIGO分期、淋巴结转移均呈负相关（P<0.05）。结论：PTEN基因突变参与卵巢癌的发生、发展，且PTEN mRNA在癌组织呈低表达，与卵巢癌FIGO分期、淋巴结转移存在相关性。

【关键词】 PTEN基因 mRNA表达 卵巢癌 生物学特征

Correlation between PTEN Gene Mutation， mRNA Expression and Pathological and Biological Characteristics of Ovarian Cancer/LIU Shuang. //Medical Innovation of China， 2021， 18（29）： -140

[Abstract] Objective： To investigate the correlation between the mutation and mRNA expression of the phosphatase and tensin homolog gene （PTEN） gene deletion on chromosome 10 and the pathobiological characteristics of ovarian cancer. Method： From January 2018 to February 2020， 62 patients with ovarian cancer in our hospital were selected as the observation group， another 48 patients with benign ovarian tumors treated during the same period in our hospital were selected as the control group. The focal tissue was taken from the control group， and the ovarian cancer tissue and paracancer tissue were taken from the observation group. PCR-SSCP was used to detect gene mutation in the observation group. PTEN mRNA levels in different tissues were determined by real-time fluorescence PCR. The correlation between PTEN mRNA level and the pathologic characteristics of ovarian cancer was analyzed. Result： Analysis of PTEN mutations in ovarian cancer tissue showed that， codon T at position 5 of exon 5 mutation to C， the amino acid changed from serine （S） to phenylalanine （F） by comparison with Blast P. The PTEN mRNA level in the observation group was lower than those in the paracancer tissues and serous cystadenoma and myxoid cystadenoma tissues in the control group （P<0.05）. There was no significant difference in PTEN mRNA level among different age， histological type and tissue grade of ovarian cancer patients （P>0.05）. PTEN mRNA levels were statistically significant in ovarian cancer patients with different FIGO stages and with or without lymph node metastasis （P<0.05）. PTEN mRNA level was negatively correlated with FIGO stage and lymph node metastasis （P<0.05）. Conclusion： PTEN gene mutation is involved in the occurrence and development of ovarian cancer， and PTEN mRNA expression is low in cancer tissues， which is correlated with ovarian cancer FIGO stage and lymph node metastasis.

[Key words] PTEN gene mRNA expression Ovarian cancer Biological characteristics

First-author’s address： Xinmin Municipal People’s Hospital， Xinmin 110300， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.29.033

卵巢癌是病灶位于卵巢的恶性肿瘤，其发病与遗传、激素因素水平存在紧密的联系[1]。既往研究表明：卵巢癌能发生在任何年龄段人群中，其组织学类型多样，主要为上皮来源，发病早期临床症状不易发现，导致临床诊疗难度较大[2]。手术治疗是卵巢癌患者常用的治疗方法，但是患者治疗后复发率较高，其预后与肿瘤病理类型、分期、治疗方案等有关[3];而化疗患者治疗耐药性日益严重，临床上找到相关耐药因子，预测化疗耐药、调整治疗方案对改善患者预后具有重要意义[4]。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（PTEN）属于是一种抑癌基因，亦是卵巢癌患者耐药的基因之一，具有双向特异性磷酸酶活性[5-6]。既往研究表明：PTEN基因既有蛋白酪氨酸磷酸活性，亦可通过多种途径激活磷酸酶活性，從而诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，在肿瘤的发生、发展及耐药性中发挥了重要作用[7]。但是，PTEN基因与卵巢癌生物学特征的关系研究较少[8-9]。本研究以卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者为对象，探讨PTEN基因突变、mRNA表达与卵巢癌病理生物学特征的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年1月-2020年2月本院62例卵巢癌患者作为观察组，另选择本院同期治疗的48例卵巢良性肿瘤患者作为对照组。纳入标准：（1）符合卵巢癌和卵巢良性肿瘤诊断标准，均经病理组织检查确诊;（2）具有完整的基线资料且患者术前未进行放化疗、生物免疫治疗;（3）均拟行手术治疗，术中获得完整的病灶组织/癌旁组织。排除标准：（1）精神异常、免疫系统疾病或代谢性疾病者;（2）凝血功能异常、其他部位恶性肿瘤后伴有自身免疫系统疾病者。本研究均获得医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）病灶组织的采集。两组均拟行手术治疗，对照组术中取病灶组织，观察组术中取癌组织与癌旁组织（距癌组织≥3 cm）;石蜡包埋后，制备5 μm厚度的切片，备用[10]。（2）仪器与设备。cDNA第一链合成预混试剂盒（购自北京天根公司）、Talent荧光定量检测试剂盒（购自北京天根公司）、荧光定量PCR仪（购自美国Bio-rad公司）。（3）PCR-SSCP和DNA测序，采用PCR技术对观察组卵巢癌组织DNA样品中完成PTEN基因外显子5扩增（正向引物：5’-TCCAATAGAAAAATGGTG-3’;反向引物：5’-TGCCCCGATGTAATAAAT-3’）[11-12]。取最终获得的PCR扩增产物3 μL，加入变性剂并根据1︰5充分混合均匀，98 ℃下10 min水浴变性，并迅速冰浴5 min。上述操作完毕后完成聚丙烯酰胺凝胶电凝，银染显带，并将DNA异常扩增产物送上海联合基因测序。（4）PTEN mRNA水平检测。①总RNA的提取。向不同方法处理后的细胞中加入200 μL氯仿，15 s振荡后进行15 min离心，速度4 500 r/min。离心完毕后去除上清，加入预冷乙醇1 mL，常温下干燥7 min;在A260吸光值下完成总RNA测定[13-14]。

②采用实时荧光PCR法测定不同组织中PTEN mRNA水平，PCR参数：30 ℃下10 min;42 ℃下30 min;99 ℃ 5 min;5 ℃ 5 min，连续进行35个循环，72 ℃ 10 min延长，放入1.5%琼脂凝胶电泳，β-actin为内对照，引物设计见表1[15]。比较不同组织的PTEN mRNA水平。（5）相关性分析。比较不同病理特征的卵巢癌组织的PTEN mRNA表达水平，取存在差异的特征因素，分析其与PTEN mRNA表达水平的相关性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验;相关性分析采用Spearman与Pearson相关性分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 观察组年龄40～69岁，平均（48.89±4.61）岁;病程0.4～1.6年，平均（1.13±0.61）年;肿瘤直径1～7 cm，平均（3.23±0.59）cm;FIGO分级：Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期25例;组织学类型：浆液性腺癌35例，黏液性腺癌16例，子宫内膜样癌11例;组织分化类型：高分化32例，中分化20例，低分化10例;盆腔淋巴结转移：是23例，否39例。对照组年龄37～69岁，平均（49.11±4.67）岁;病程0.4～1.9年，平均（1.11±0.58）年;病灶部位：左侧31例，右侧17例;组织学类型：浆液性囊腺瘤26例，黏液性囊腺瘤22例。

2.2 卵巢癌组织PTEN基因突变分析 观察组62例卵巢癌组织经PCR-SSCP检测，出现遗产条带的38例PCR产物，经纯化测序后进行分析与比较，结果表明：外显子5第5位密码子T突变为C，经Blast P比较发现氨基酸由丝氨酸（S）变为苯丙氨酸（F）。

2.3 两组PTEN mRNA水平比较 对照组中浆液性囊腺瘤与黏液性囊腺瘤PTEN mRNA水平分别为（0.67±0.11）、（0.68±0.12），比较差异无统计意义（t=0.426，P>0.05）。观察组中癌组织PTEN mRNA水平为（0.32±0.08）低于癌旁组织（0.87±0.15），差异有统计学意义（t=25.475，P<0.05）;观察组癌组织PTEN mRNA水平低于对照组中浆液性囊腺瘤与黏液性囊腺瘤组织，差异均有统计学意义（t=16.689、15.782，P<0.05）。

2.4 观察组不同病理特征的卵巢癌组织PTEN mRNA水平比较 不同年龄、组织学类型及组织分级卵巢癌组织PTEN mRNA水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;不同FIGO分期及有无淋巴结转移的卵巢癌组织PTEN mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.5 PTEN基因表达水平与卵巢癌病理生物学特征相关性分析 PTEN mRNA表达水平与FIGO分期、淋巴结转移均呈负相关（P<0.05），见表3。

3 讨论

卵巢癌是女性发病率较高的恶性肿瘤，由于患者发病早期症状缺乏典型性，导致临床诊疗难度较大[16]。手术、化疗是卵巢癌患者中常用的治疗方法，虽然能改善患者症状，延长患者寿命，但是手术治疗具有一定的风险性、创伤性，而化疗耐药性较高，导致患者生存率较低，影响女性健康生活[17]。既往研究表明：化疗耐药是卵巢癌患者治疗预后差的重要原因，由于患者治疗过程中肿瘤细胞为了躲避药物对其攻击、抵制其发挥作用，而产生耐药性[18]。PTEN基因是临床发现的首个具有抑癌作用的见，含有磷酸酶活性，且该基因主要定位于10q23.3染色体上，能表达丝氨酸、苏氨酸与磷酸络氨酸残基，从而能降低FAK酶活性，在肿瘤浸润、转移中发挥了重要作用[19]。本研究中，卵巢癌患者经PCR-SSCP检测，结果表明外显子5第5位密码子T突变为C，经Blast P比较发现氨基酸由丝氨酸（S）变为苯丙氨酸（F），提示PTEN基因突变在卵巢癌的发生、发展中发挥了重要作用。

PTEN基因突变与卵巢癌等肿瘤的发生具有紧密的联系，该基因外显子5突变能引起相应蛋白结构、功能异常[20]。本研究中，观察组中卵巢癌组织PTEN mRNA水平低于癌旁组织和对照组中浆液性囊腺瘤与黏液性囊腺瘤组织（P<0.05）;不同年龄、组织学类型及组织分级的卵巢癌患者PTEN mRNA水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;不同FIGO分期、有无淋巴结转移的卵巢癌患者PTEN mRNA水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05），提示PTEN基因表达水平与卵巢癌患者病理存在紧密的联系。PTEN基因突变在卵巢癌患者中能引起轉录、修饰等遗传化发生变化，能引起基因表达水平下调。文献[21]研究表明，PTEN基因即耐药基因，阻滞细胞周期，在细胞迁移过程中发挥作用。同时，PTEN能参与肿瘤的形成，其表达水平下降或缺失时，则会增强化疗药物的敏感性，其表达水平能反映肿瘤的恶心程度。为了进一步分析PTEN基因表达水平与卵巢癌生物病理的关系，本研究中对其进行相关性分析结果表明：PTEN mRNA水平与FIGO分期、淋巴结转移均呈负相关（P<0.05）。因此，卵巢癌患者治疗过程中应用加强PTEN基因表达水平测定，评估患者预后，指导患者术后治疗，巩固手术效果，促进患者恢复。

综上所述，PTEN基因突变能参与卵巢癌的发生、发展，且在卵巢癌组织中PTEN mRNA呈低表达，与卵巢癌病理生物学特征存在相关性。

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（收稿日期：2020-12-28） （本文编辑：田婧）