大豆亲脂蛋白热诱导解离缔合及自组装纳米颗粒表征

孙冰玉 刘琳琳 石彦国 朱秀清 张 娜 曾剑华

(哈尔滨商业大学食品工程学院， 哈尔滨 150076)

0 引言

热处理是大豆食品加工过程中必不可少的操作单元，通过杀菌、钝化抗营养因子等作用而获得理想功能品质的产品[1-2]。热处理使蛋白逐渐变性，蛋白分子历经结构展开、解聚和再聚集等过程；形成的蛋白聚集状态主要有无定性聚集和纤维化聚集两种形式，其中无定性聚集是工业化热处理过程中蛋白的主要聚集状态；通常认为蛋白热聚集过程中主要作用力为疏水相互作用、静电引力、氢键和二硫键[3-5]。通过调控热处理过程中蛋白亚基的解离缔合反应、控制形成聚集体的状态可以获得具有优良功能性质的聚集体。文献[6]研究显示，在120℃条件下能诱导大豆分离蛋白形成可溶性无定型聚集体，其乳液具有优良的冻融稳定性[6]。

大豆亲脂蛋白(Soybean lipophilic protein，SLP)是一种有别于大豆球蛋白和伴大豆球蛋白的富含磷脂高疏水性的大豆蛋白组分[7]，具有良好的物理和生物功能特性[8-10]。如SLP可通过物理作用而非生理调控降低血液胆固醇和三酰基甘油；SLP纳米乳液可作为共轭亚油酸的输送载体；SLP能显著降低界面张力，并呈现出耐盐耐热性；添加0.1%的羟丙基甲基纤维素能提高SLP的乳化功能。文献[11]研究发现，SLP与大豆蛋白的溶解行为具有相关性，从而推测SLP有可能是提高大豆分离蛋白溶解性和改善界面特性等功能的关键因素。近年来，自组装纳米颗粒引起了物理、化工和医药等领域学者的广泛关注，即通过在纳米尺度上调控粒子间的相互作用来控制粒子在整个组装体上的分布，并着重于构建有序和复杂的结构。自组装颗粒超级结构因具有不同于或优于基础粒子结构的特性和功能，而被广泛应用于药物传递、催化、医学诊断和传感器等领域[12]。植物球蛋白(如大豆蛋白、玉米醇溶蛋白)因其具有良好的生物兼容性、可持续性和环境友好性而被广大学者作为基础材料用于蛋白纳米颗粒自组装研究[13]中。SLP具有明显的亲水、疏水核心，且具有较高的疏水性，强的疏水作用可以驱动SLP分子自组装[14]。然而，目前关于热处理过程中SLP的构象变化和纳米颗粒自组装行为的研究鲜有报道。

本文以SLP为研究对象，采用多光谱、热分析技术、化学分析法和微观成像技术表征热诱导对SLP结构和纳米颗粒自组装的影响，以期为SLP专用大豆蛋白粉和SLP在食品领域的开发应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷榨大豆粕，黑龙江鹤旭食品有限公司；一级大豆色拉油，九三粮油工业集团有限公司。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、四甲基乙二胺、过硫酸铵、考马斯亮蓝 R250，分析纯，上海索莱宝生物科技有限公司；正己烷、氯仿、甲醇、 β-巯基乙醇、甲醇、冰醋酸、甘氨酸(Gly)、尿素、 5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(TDNB)、三氯乙酸(TCA)、 磷酸盐缓冲溶液(PBS)、溴化钾、溴酚蓝，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-3C型pH计，上海雷磁有限公司；79-1型磁力搅拌器，江苏国华仪器厂；HH-4型恒温水浴锅，江苏金坛宏华仪器厂；DYY-6D型电泳仪，北京六一电泳仪仪器厂；ALPHA 1-2 LD plus型冷冻干燥机，德国Christ公司；ALPHA 1650型紫外可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司；Lambda365型紫外光谱仪、Spectrum Two型红外光谱仪和DSC-4000型差示量热扫描仪，美国珀金埃尔默股份有限公司；F-7000型荧光光谱仪，日本日立仪器(上海)有限公司；Chirascan CD型圆二色谱仪，英国应用光物理公司；Nano-ZS-90型马尔文激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1SLP制备

SLP的制备参照文献[15]，具体方法如下：冷榨豆粕在浓度为0.5 mol/L、pH值8.5的Tris-HCl缓冲液，55℃条件下水浴提取60 min，经4 000 r/min离心20 min，取上清液，将上清液pH值调至6.4静置30 min，在4 000 r/min离心20 min；上清液pH值调至5.2静置30 min后，将pH值调回至5.5，在4 000 r/min离心20 min分离出沉淀即为SLP；沉淀用适量去离子水溶解并将pH值调至7，透析48 h，冷冻干燥。

1.3.2热诱导处理

将SLP粉末用10 mmol/L pH值7.2的PBS配制成蛋白质量浓度为10 mg/mL的溶液，在不同温度条件(25～95℃)下分别诱导5、10、15、20、30 min；诱导结束后迅速冰水浴冷却至室温(20℃)并储藏于4℃或冷冻干燥备用。

1.3.3巯基、二硫键含量测定

蛋白质巯基、二硫键含量参考Ellman试剂法[16]测定。

1.3.4粒径和电位测定

取10 mg/mL的SLP上清液1 mL于PCS8501型石英测试池中，利用马尔文激光粒度仪Trend程序升温和程序降温功能对SLP在热诱导过程中粒径和电位的变化进行实时监测，具体参数设置如下：温度25～90℃、测试间隔为5℃、每个测试点平衡120 s、平行测量3次。

1.3.5紫外光谱

将样品稀释成质量浓度为0.1 mg/mL的溶液，10 000 r/min离心1 min，取上清液用于紫外光谱分析。波长为190～800 nm，分辨率为0.2 nm，扫描速率为600 nm/min。所得的一阶紫外光谱通过Origin 2017软件微分得到二级衍生紫外光谱。

1.3.6内源荧光光谱测定

将样品液用pH值7.2的PBS稀释为质量浓度0.1 mg/mL，在激发和发射狭缝均为5 nm、电压为500 V条件下，以激发波长295 nm，从波长300～400 nm扫描得到荧光光谱，扫描3次取平均值最后得到内源荧光光谱图。

1.3.7外源荧光光谱测定

取4 mL浓度为0.1 mol/L的蛋白样品溶液，加入20 μL浓度为8 mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸荧光探针，摇匀，静置3 min；测试条件为：狭缝为5 nm、激发波长390 nm、扫描400～600 nm内荧光发射光谱。

1.3.8傅里叶红外光谱

将冻干的SLP样品置于干燥器内，充分干燥，精确称取2 mg干燥的样品，加入200 mg的KBr，进行研磨混合均匀，然后进行压片，红外光谱扫描，扫描波段4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32。采集的红外图谱进行基线校正和平滑处理后，使用Peakfit 4.0.2结合Origin 2017对蛋白酰胺I带(1 700～1 600 cm-1)做二阶导数、去卷积和高斯曲线拟合，根据峰面积计算各种二级结构的相对含量。

1.3.9圆二色谱

将样品用磷酸盐缓冲液(pH值7.2，浓度0.01 mol/L)稀释成质量浓度0.2 mg/mL，采用Chirascan CD圆二色谱在波长范围为190～260 nm内扫描3次取平均值，光径10 mm，扫描频率为90 nm/min，间隔时间0.25 s，以相应磷酸盐缓冲液为溶剂空白。

1.3.10聚丙烯酰氨凝胶电泳

聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析参照文献[17]的方法，将2.0 mg/mL样品与含有SDS和β-巯基乙醇的上样缓冲液以体积比1∶1混合，沸水浴蒸煮10 min。上样量均为20 μL，浓缩胶和分离胶质量分数分别为5%和12%，凝胶板厚度为15 mm，电泳缓冲溶液采用Tris-甘氨酸-SDS缓冲体系。Native-PAGE 电泳分析与SDS-PAGE电泳分析类似，不同的是样品缓冲溶液及电泳缓冲溶液中无SDS和β-巯基乙醇，电泳缓冲溶液中无SDS，且上样前也不经过加热处理。

1.3.11扫描电镜

取适量冻干后的样品均匀粘在扫描电镜观察台上，用Q150T ES型粒子溅射镀膜仪给样品镀金，厚度约为15 nm，采用Hitachi S3400型扫描电镜观测，仪器观测参数：加速电压5 kV、放大倍数500倍。

1.4 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 22.0对数据进行处理和显著性分析，通过Origin 2017绘图，实验结果除有特殊说明外，均为3次平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 热诱导对SLP结构影响分析

2.1.1热诱导对SLP三级构象的影响

在280 nm附近的紫外吸收峰为蛋白芳香族氨基酸残基特征吸收峰，因色氨酸紫外吸收峰较宽而基本掩盖了酪氨酸的吸收峰，但蛋白酪氨酸和色氨酸残基对苯丙氨酸氨基在250～270 nm处的吸收峰基本没有影响，因而常规紫外光谱难以区分蛋白构象变化过程中酪氨酸和色氨酸的行为。紫外二阶导数光谱在解析温度、pH值和化学因子等引起蛋白精细结构变化中芳香族氨基酸贡献具有重要作用，研究表明蛋白紫外二阶导数光谱中酪氨酸和色氨酸残基吸收峰的波峰和波谷的距离a(284～288 nm)和b(291～296 nm)的比值r(a/b)能表征蛋白构象变化构成中酪氨酸暴露程度[18-19]。

热诱导对SLP紫外二阶导数光谱的影响如图1所示，当温度高于90℃时，紫外二阶导数光谱显示SLP紫外二阶导数吸收光谱发生1～2 nm蓝移，但296 nm处未发生变化(数据未给出)；表明热处理使得SLP埋藏于内部的酪氨酸残基暴露于亲水环境中。总体上，随着温度的升高，r呈先增大后降低的趋势(图1)，在90℃具有最大值，在该条件下SLP构象伸展至最大程度，即此时SLP微环境变得更加亲水，酪氨酸暴露程度更高。

进一步采用内源荧光光谱分析热诱导过程中由色氨酸和酪氨酸残基微环境极性变化引起SLP三级构象的变化，热诱导对SLP内源荧光光谱的影响如图2所示，对外源荧光光谱的影响如图3所示。与对照组(25℃)相比，基本上随着热诱导温度和时间的增加，SLP的最大荧光强度(Fluorescence intensity，FI)逐渐下降(图2f)；当温度低于90℃时，热诱导SLP最大吸收波长(λmax)发生明显的蓝移现象，表明SLP三维构象发生改变并且色氨酸和酪氨酸等发色基团微环境变得更疏水，原先暴露于表面的色氨酸等基团重新埋藏于SLP内部；当温度高于90℃时，SLP的λmax显著地向大波长方向移动；表明该条件下热诱导SLP能逐步暴露出埋藏于SLP内部疏水环境的发色基团。文献[20]研究也发现热处理能使SPI的λmax发生红移。

由图3可知，SLP的表面疏水性指数随着热处理温度和时间的增加而逐渐增大，表明热处理过程中SLP分子逐渐暴露出埋藏于分子内部的非极性侧链，这与内源荧光和紫外二阶导数分析结果相一致；此外，文献[21]研究也发现能量调控过程中能使SPI表面疏水性急剧增加。

2.1.2热诱导对SLP二级构象的影响

研究显示蛋白在热诱导过程中会发生化学键的断裂，如维持蛋白高级结构的氢键、范德华力等次级键以及维系亚型结构的二硫键断裂使得蛋白聚集，从而使蛋白结构发生变化。热诱导对SLP圆二色谱的影响如图4a～4e(图中CD值是指椭圆率)所示，短时间热处理(5 min)后，SLP圆二色谱的谱型基本保持不变，表明SLP具有一定耐热性，这与SLP中11S具有较高的热稳定性有关；随着热诱导时间的增加，当温度小于80℃时，SLP谱型基本类似；而当温度大于80℃时，SLP的CD谱型发生显著性改变，表明高温处理能显著改变SLP二级结构。文献[22]研究显示桑葚凝集素在低于80℃处理时，其CD谱型基本保持不变。随着能量输入，SLP的CD图谱(图4f)中218 nm处β-折叠峰型逐渐凸显，表明热诱导使得SLP的β-折叠结构含量增加。文献[23]研究显示热诱导后α-突触蛋白的β-折叠结构含量增加，且伴随着表面疏水性增强，从而有助于蛋白自组装行为的发生；因此，β-折叠结构含量增加可能与SLP解离缔合行为密切相关。

2.1.3热诱导对SLP构象稳定性的影响

天然SLP(25℃)的变性峰为74.63℃和92.88℃，对应焓值为0.99 J/g和3.44 J/g，如图5(图中ΔT表示温度变化量，ΔH表示焓值变化量)所示，当热处理温度小于等于80℃时，SLP基本保持大部分天然蛋白构象，而100℃处理时，SLP基本变性。而当处理温度为90℃时，DSC(差示扫描量热分析)未检测到7S变性峰，表明7S球蛋白基本都发生变性；而11S变性峰则逐渐增强，在热处理20 min时变性温度最大为95.14℃，同时也具有相对较高的焓值，为4.38 J/g，表明在90℃处理20 min冷冻干燥后保持一定的天然构象并且热稳定性增加，持续的能量调控使蛋白解离，当能量调控结束后蛋白亚基重新缔合或排列成结构热稳定性更高的可溶性蛋白聚集体，这与FTIR结果分析一致。

综上所述，由热诱导对SLP构象影响可知，80～90℃范围是SLP热处理分界线，在热处理温度低于80℃时，在本次实验数据范围内，SLP能基本保持天然构象不发生显著性变化，而在热处理温度高于90℃时，SLP蛋白二级构象发生显著性改变，在90℃处理20 min时，SLP蛋白结构解聚伸展至最大程度，表面疏水性增加，分子间聚集程度增大，同时热稳定性增强。

2.2 热诱导SLP聚集体形成分析

蛋白质经热诱导后维持蛋白高级结构的氢键、范德力等次级键以及维系亚型结构的二硫键断裂使蛋白分子解离成亚基单位，从而引起蛋白高级结构发生变化；而当能量调控结束后，解离的亚基会重新聚集形成可溶性聚合物和难溶性聚合物，在90℃处理不同时间SLP的Native-PAGE和SDS-PAGE如图6所示。

Native-PAGE显示在90℃诱导SLP主要形成3个中间组分，分别为难溶性组分M1和高分子聚合物M2(180 ku以上)以及大分子聚合物M3(90.5 ku)；而SDS-PAGE显示在原来形成的中间产物(M1～M3)位置完全消失，取而代之的是7S和11S的α、α′和β以及A3、A和B亚基，且主要为胱氨酸和半胱氨酸含量高的11S球蛋白亚基。这表明热处理过程中SLP亚基经历蛋白结构伸展、亚基解离并暴露出疏水性基团，而后SLP的亚基单位通过疏水相互作用和二硫键缔合重新聚集形成中间产物。

通过测定在90℃加热不同时间SLP的巯基和二硫键的变化可以进一步判定二硫键在热处理过程中SLP亚基重新聚集的重要性程度。如图7所示，短时间的能量调控(0～5 min)时二硫键和游离巯基含量无明显变化，即表明此时SLP构象并未发生显著性改变，这与本研究构象结构分析一致。当热处理时间增加，可以发现游离巯基含量逐渐下降、而二硫键含量逐渐增加；这与图6中M1～M3中间产物灰度随着热处理时间的延长而增加的现象相吻合；文献[24]研究结果显示苦杏仁蛋白在热处理过程中亚基重新排列并通过二硫键形成分子质量在70～88 ku的中间产物。

2.3 热诱导对SLP自组装纳米颗粒尺寸的影响

热诱导形成SLP自组装纳米颗粒调控温度的选择受SLP变性温度的影响。SLP有两个变性温度，分别为74.63℃和92.88℃，因SLP中11S球蛋白含量最多(质量分数约40%)，因此SLP具有相对较高的热稳定性，如果想利用热诱导形成SPL自组装纳米颗粒，就要选择相对较高的调控温度。由图8(图中浊度以600 nm处OD值表示)和表1可知，在60、70、100℃诱导处理SLP的PdI(多分散系数)大于0.2；而在80℃和90℃处理时SLP的多分散系数接近0.2并趋于单分布；相比80℃，在90℃处理时形成的SLP纳米颗粒自组装平均粒径和表面电荷相对稳定，平均粒径在100～110 nm、表面电荷在-23～-20 mV。随着热诱导时间的延长，SLP平均粒径逐渐增大、Zeta电位绝对值逐渐减小并伴随着浊度的升高，表明热诱导SLP自组装形成大量纳米胶体颗粒。在90℃处理20 min时SLP能形成相对稳定的单分散纳米颗粒。

表1 热诱导对SLP纳米颗粒自组装的多分散系数和电位的影响Tab.1 Effect of heating induction on PdI and Zeta potential

在热诱导过程中，SLP的Zeta电位呈下降趋势，即SLP表面带电量减少，从而引起蛋白分子之间静电斥力减弱；但Zeta电位仍维持相对较大的数值(绝对值大于15 mV)，因而分子间静电引力较弱，从而推测热诱导引起SLP分子间聚集的主要作用力不是静电引力。

SLP的程序升温和程序降温显示SLP纳米颗粒自组装具有调控规律，如图9所示，在温度上升过程中，在55℃前粒径基本保持不变，当温度上升到60～90℃时，粒径增大，这可能是蛋白受热后结构得到适当伸展，导致粒径增大；在90℃时粒径急剧下降，这可能是维持蛋白亚型结构的次级键如氢键、范德华力以及二硫键断裂导致SLP分子解聚形成亚基，从而导致SLP粒径减小。在降温过程中的初始阶段(90～100℃)，可能是体系中仍维持有较高的能量，SLP粒径变化较小，当温度进一步下降时，在80℃时SLP粒径急剧增大，这可能是因为当能量撤去后，氢键和范德华力以及二硫键的形成速率大于分解速率，SLP游离亚基逐渐聚集，且聚集程度随着温度降低而逐渐增大，从而表现出SLP粒径增大；这与上文热诱导对SLP构象影响分析结果相一致。

2.4 显微成像分析

由图10可知，天然SLP呈大小不一、棱角分明和质地相对密实的片状；当SLP进行热处理后(60～90℃)，如图10b～10e所示，SLP结构变得相对疏松、棱角逐渐消失，颗粒细小化并呈均匀分布，这可能是热诱导引起维持SLP高级结构作用力如氢键、二硫键断裂，促使SLP分子亚基解聚形成分子量相对较小的颗粒。当热处理温度过高时(90℃以上)，SLP通过强烈的疏水相互作用聚集成更大的颗粒(图10f)。此外热处理后溶液中的SLP分子结构展开并暴露出更多的游离巯基和疏水性基团于分子表面，但在后续冷冻干燥过程中SLP的游离亚基通过游离巯基和疏水相互作用重新聚集形成较大的聚集体[25]。

综上，综合SLP在热诱导过程结构变化规律、亚基解离缔合行为以及粒径的变化趋势和微观形貌结果，可推测90℃是SLP蛋白分子温度的调控关键点。在热处理过程中，SLP中维持分子结构稳定的氢键、范德华力等次级键和二硫键发生断裂，蛋白结构伸展、解离，含有胱氨酸和半胱氨酸的侧链暴露，表面疏水性增加，三级构象伸展程度最大，且二级构象显著改变，并伴随着β-折叠含量增加和-螺旋含量下降，分子间聚集程度增大，同时热稳定性增强。暴露出的胱氨酸和半胱氨酸的巯基(—SH)在热处理过程中氧化形成极不稳定的中间硫化物，并在冷却过程中两个相邻的不稳定中间硫化物极易形成二硫键，从而生成了以二硫键和疏水相互作用为主要作用力的热诱导中间产物(M1～M3)。在热诱导20 min时，SLP可自组装形成相对稳定的单分布纳米颗粒体系，如图11所示。

3 结束语

采用多光谱技术、热分析技术以及凝胶电泳和动态光散射研究了热诱导过程中SLP纳米颗粒自组装。结果显示，80～90℃是SLP热处理分界线，在热处理温度低于80℃时，SLP能基本保持天然构象，不发生显著性变化，而在热处理温度高于90℃时，SLP蛋白二级构象发生显著性改变。在90℃处理20 min时，SLP蛋白结构解聚、伸展至最大程度，表面疏水性增加。解离后的亚基通过二硫键和疏水相互作用重新聚集成中间聚集体，导致分子间聚集程度增大、构象稳定性增强。SLP自组装形成粒径约为110 nm的稳定单分布纳米颗粒体系。