超声复合碱处理大豆蛋白与EGCG复合物功能特性研究

2021-03-20闫世长徐静雯谢凤英武利春齐宝坤

农业机械学报 2021年2期

李杨闫世长徐静雯谢凤英武利春齐宝坤

(1.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030； 2.国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨 150030)

0 引言

大豆分离蛋白(Soybean protein isolate，SPI)具有加工性能好、营养价值高、成本低等优点，在食品工业中得到了广泛的应用。SPI在特定食品中的应用形式因其性质而不同，如乳化性、溶解性、凝胶性、分散性以及粘度等。在天然状态下，大豆蛋白的主要成分是储藏蛋白，即7S和11S球蛋白，占总蛋白的65%～80%，蛋白质的致密球状结构与低分子柔性以及不良的界面和乳化特性有关[1]。因此，研究者尝试采用许多技术来修饰和改变大豆蛋白的结构和聚集状态。

超声已被引入来改变食品的功能特性，可依靠产生的空化作用或机械剪切应力破坏蛋白的肽键以及非共价相互作用，改变蛋白的二级结构和疏水性[2]。超声与一些技术相结合可以改善蛋白质的功能特性。pH变换技术简单、易操作，且可以利用静电排斥作用使蛋白解折叠与亚基解离，尤其是在远离蛋白等电点的pH值下，因此，超声常与pH变换相结合来改善蛋白的功能特性[3]。文献[4]报道了超声联合pH处理可使豌豆蛋白结构发生改变，进而改善其功能特性。文献[2]研究发现，超声复合酸处理可以改变SPI的结构，使蛋白聚集体粒径减小、乳化性增强。文献[3]阐明了超声复合碱处理对Oleosin蛋白的结构及功能性的影响，超声复合碱处理可改善蛋白结构，提高其乳化性。文献[5]研究发现，超声复合碱处理较单独处理技术更能改善乳蛋白的结构与乳化特性。然而，超声等物理改性虽可提高蛋白的功能特性，但产生的自由基却可能加速蛋白的氧化[6]，从而限制了其在工业中的高值化应用。

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)具有抗菌、抗氧化、抗炎以及抗肿瘤作用[7-9]，且具有较强的蛋白亲和性，可以与蛋白复合形成具有功能性质的复合体系[10]。文献[11]研究发现，EGCG与SPI相互作用，可改变蛋白的结构，复合物的乳化性与抗氧化性均得到改善。文献[12]研究发现，EGCG与卵清蛋白相互作用，降低了蛋白的致敏性，提高了蛋白的乳化性。一些学者还研究了改性蛋白与多酚的相互作用。文献[13]研究发现，热与花青素改性SPI使蛋白复合物乳化性得到改善。文献[14]研究发现，超声改性的大豆蛋白与花青素的相互作用使乳化性能明显提高。文献[15]利用超声辅助大蒜素来改善乳清蛋白的结构，进而提高蛋白的溶解度与乳化特性。文献[16]利用碱处理辅助EGCG改性乳清蛋白，复合物的乳化性与抗氧化性得到增强。由此可知，多酚类成分与蛋白相互作用可以用来改善蛋白的结构与功能，且可以清除氧化自由基，这拓展了蛋白在功能性食品中的应用。然而，关于超声复合碱处理SPI与EGCG复合对蛋白的结构与功能的影响尚未见报道。

本文主要采用荧光光谱、红外光谱探究超声复合碱处理SPI和EGCG复合体系对蛋白结构的影响，通过粒度分析、Zeta电位、浊度、乳化性及乳化稳定性探究超声复合碱处理SPI与EGCG复合体系对蛋白功能性质的影响及变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆，市售；EGCG(纯度99%以上)，上海源叶生物科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醇，均为分析纯，北京新光化工试剂厂；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204型分析天平，梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司；PHS-3C型实验室pH计，中国上海雷磁公司；F-6000型荧光分光光度计，日本Hitachi公司；TU-1800型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JJ-1型增力电动搅拌器，江苏金城国胜仪器厂；Allegra64R型台式高速冷冻离心机，美国贝克曼公司；IRTracer-100型傅里叶变换红外光谱分光光度计，日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1样品制备

(1)大豆分离蛋白制备

根据文献[13]的方法，将大豆磨粉，过60目筛，用正己烷脱脂，将脱脂豆粉分散于去离子水中，液料比10 mL/g，用2 mol/L NaOH 溶液调节pH值至9.0，搅拌1 h，9 000 r/min离心30 min，取其上清液，然后用2 mol/L HCl溶液调节pH值至4.5，得到蛋白沉淀物，将蛋白沉淀物水洗3次，6 500 r/min离心30 min得到沉淀物，将该沉淀物溶解后，用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至中性，冻干，即得大豆分离蛋白，使用凯氏定氮法测定蛋白含量，蛋白质量分数为(92.28±0.31)%。

(2)超声复合碱处理SPI和EGCG复合物制备

SPI的处理方法参照文献[2,16]的方法进行。

对照组(SPI)：称取大豆蛋白1.0 g，溶解到100 mL的去离子水中，在25℃下搅拌1 h，搅拌过程中利用0.1 mol/L NaOH 维持pH值为7.0，然后在5 000 r/min的条件下离心15 min，得上清液，然后冻干。

超声复合碱处理(UHSPI)：称取大豆蛋白1.0 g，溶解到100 mL的去离子水中，25℃下搅拌1 h，搅拌过程中利用0.1 mol/L NaOH 维持pH 值7.0，200 W超声处理5 min(工作5 s、间隔5 s)，随后调节pH值至12，保持1 h，随后再调节pH值至7.0，然后在5 000 r/min条件下离心15 min，得上清液，然后冻干。

根据文献[17]的方法进行SPI和EGCG复合物的制备，将SPI和UHSPI粉末溶解在10 mmo/L的PBS(磷酸盐缓冲液，pH值7.0)中，在室温(20℃)下连续搅拌30 min，加入EGCG粉末，蛋白与EGCG质量比为100∶1，连续搅拌90 min。络合后，将混合溶液冻干进行后续分析。

1.3.2红外光谱

用IRTracer-100型傅里叶变换红外光谱分光光度计在室温下记录样品的红外光谱。将样品与KBr混合，然后压片。在500～4 000 cm-1范围内记录光谱，分辨率为4 cm-1。采用Peakfit 4.12软件，利用高斯曲线拟合方法拟合α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的特征峰[17]，分析其含量。

1.3.3荧光光谱

向10 mL的SPI溶液(0.5 mg/mL, 10 mmol/L PBS, pH值7.0)中分别逐滴加入100 μL浓度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μmol/L的EGCG溶液，旋涡振荡后应用F-6000型荧光分光光度计测定样品的荧光淬灭光谱[17]。光谱测定条件设置为：激发波长280 nm，扫描波长为300～450 nm，激发狭缝、发射狭缝为5 nm，扫描速率为600 nm/min。蛋白及复合物的荧光测定条件为，室温条件下，以280 nm为激发波长，扫描波长为300～450 nm。荧光淬灭机制可分为动态淬灭与静态淬灭两种机制，应用Stern-Volmer方程判断猝灭类型，公式为

(1)

式中F0、F——未加入、加入EGCG时SPI溶液的荧光强度

Q——EGCG的浓度，mol/L

Kq——双分子猝灭常数，L/mol

Ksv——动态猝灭速率常数，L/(mol·s)

τ0——猝灭剂不存在时荧光体的寿命，生物大分子的平均寿命约为10-8s

一般情况下，猝灭剂对于生物大分子最大动态猝灭速率常数为2×1010L/(mol·s)，当大于这一速率时，则为静态淬灭，静态淬灭满足公式

lg((F0-F)/F)=lgKa+nlgQ

(2)

式中Ka——表观结合常数

n——结合位点数

1.3.4粒径

利用Zetasize Nano ZS90型纳米粒度及Zeta电位分析仪对样品溶液进行粒径分布测定。颗粒折射率1.45，分散剂折射率1.33，吸附率0.001。实验采用体积平均直径D[4,3]表征粒径大小并记录溶液粒径的PDI(多分散指数)[13]。

1.3.5电位

采用Zeta电位仪测定样品的Zeta电位，对样品溶液进行适度稀释(样品质量浓度为1 mg/mL)，上样量为1 mL，测定温度为25℃，温度平衡时间为2 min[18]。

1.3.6浊度

将待测样品适当稀释后(样品质量浓度为5 mg/mL)倒入石英比色皿中，并利用紫外分光光度计在波长600 nm处测定样品吸光度，用吸光度表示其浊度[19]。

1.3.7乳化特性

参照文献[13]的方法稍作修改。将样品溶在PBS(10 mmol/L，pH值7.0)中至蛋白质量浓度为1 mg/mL，向稀释的样品中加入葵花油，水相与油相体积比为3∶1，使用高剪切均质机以10 000 r/min均质3 min形成乳状液，立即从其乳状液底部提取50 μL的乳液分散于0.1%的十二烷基硫酸钠溶液稀释100倍。经旋涡振荡后用分光光度法在波长500 nm处测定样品的吸光度A500nm，用相同浓度十二烷基硫酸钠溶液作为空白对照，经10 min后再次测量其吸光度。乳化活性指数直接用乳液吸光度表示，乳化稳定性指数计算公式为

(3)

式中A0、A10——乳状液在0、10 min时的吸光度

ESI——乳化稳定性指数，min

1.4 数据统计

所有实验重复3次，实验结果采用平均值±标准差表示。利用SPSS 20软件进行ANOVA差异显著性分析及相关分析，当P<0.05差异性显著。利用Origin 2020进行制图。

2 结果与分析

2.1 红外光谱分析

表1 加入EGCG前、后SPI的二级结构相对含量Tab.1 Changes in the secondary structure content of SPI before and after adding EGCG %

2.2 荧光光谱分析

内源性荧光对蛋白质的色氨酸残基所处的微环境变化和蛋白质三级结构变化具有较高的灵敏度，因此常作为检测蛋白质空间结构变化的手段。如图2所示，与SPI相比，UHSPI的荧光强度显著增加且发生明显的红移现象，这可能由于pH值12远离蛋白等电点(pI值约为4.5)，提供较多的静电斥力，超声产生的空穴效应及剪切应力作用于SPI，破坏蛋白分子之间的相互作用，使蛋白分子展开，发色基团暴露[2,5,16]。此外，与EGCG复合之后，复合物的荧光强度均降低，表明EGCG对蛋白的荧光起到猝灭作用[17]，同时发现SPI-EGCG复合物的最大吸收波长发生了红移，UHSPI与EGCG作用荧光淬灭最明显，表明EGCG与UHSPI的结合程度最强，可能是因为超声处理、碱处理与EGCG协同改变了SPI的结构构象，发色基团的微环境发生改变，由疏水环境变为亲水环境，肽链结构舒展[14,16]。

2.3 粒径分析

粒径可以直观地表示蛋白聚集体的形成。如图3(图中不同字母表示差异显著)所示，与SPI相比，UHSPI的粒径明显减小，这可能因为超声的空化和机械作用、碱处理产生的静电斥力而最大程度地诱导较大的聚集蛋白塌陷和解离[2,23]，二者协同使蛋白结构展开、蛋白分子间作用减弱、亚基发生解离，粒径变小[3,5]，该结果与文献[5]的研究结果一致。此外，与SPI相比，当SPI与EGCG复合后，其粒径显著减小，且UHSPI-EGCG具有更小的粒径，溶液PDI最小(0.32)，表明颗粒分布最为均一。这可能是由UHSPI与EGCG形成的复合物具有最强的负电性所致[13]。此外，文献[24]表示，蛋白与多酚复合后，会较为明显地改变蛋白的性质，使二者内部连接更紧密，从而改善溶液的粒径分布情况。

2.4 电位分析

Zeta电位可以表征粒子之间的相互吸引能力。通过电位可以表征溶液的稳定性，电位的绝对值越大，产生的静电斥力越大，粒子之间越不容易发生相互碰撞导致聚集，反之，绝对值越小，粒子间越易相互碰撞发生聚集形成大颗粒[13]。与对照SPI相比((-12.48±0.18)mV)，UHSPI电位((-19.69±0.21)mV)绝对值显著增加(P<0.05)，这可能是当pH值变换(pH值由12到7)时，蛋白发生了解折叠的结构变化，带电基团暴露[4,16]。此外，超声利用空化作用打开蛋白结构[2]，超声的空穴效应及机械剪切与碱提供的静电斥力相协同，导致蛋白结构伸展，疏水性残基及带电基团暴露，电位绝对值增加[5]。

SPI与EGCG复合后，溶液的电位绝对值均显著增大(P<0.05), SPI-EGCG的电位为(-13.88±0.46)mV，UHSPI-EGCG的电位((-21.08±0.16)mV)绝对值最大。可能是由于EGCG带负电荷，并且在中性条件下酚羟基可以去质子化，所产生的氧中心可以输出较高的负电荷密度，与蛋白的正电基团结合，使得SPI的负电荷相对增加[13]。此外，文献[18]研究表明，多酚与乳蛋白复合后，可降低蛋白的等电点，复合物的负电性增强。

2.5 浊度分析

浊度的变化可以反映粒子的聚集情况，浊度主要与溶液的颜色、粒子的粒径等有关[25]。与SPI(0.26±0.014)相比，UHSPI浊度(0.083±0.013)明显减小，这可能是因为超声改变了蛋白的三、四级结构，以及碱处理提供的静电斥力，使蛋白与蛋白的相互作用减小，浊度减小，从而提高溶液体系的稳定性[3-5,16]。

SPI与EGCG复合之后，所有复合物溶液的浊度与单纯蛋白溶液相比均显著增加，SPI-EGCG的浊度为0.367±0.012，且UHSPI-EGCG具有最小的浊度(0.135±0.016)，这可能是由于复合物溶液的粒径减小，PDI降低，溶液分散均匀，导致光发生漫反射，从而导致浊度的增加[24,26]。该结果与文献[19]的研究结论一致，花青素与SPI相互作用，使蛋白的结构改变，粒径更加均匀，光的漫反射增加，溶液浊度增加。此外，由于EGCG在中性及碱性条件下不稳定，易氧化成棕色的醌类物质，所以，溶液的颜色加深，也可能导致浊度增加[25]。

2.6 乳化特性分析

乳化活性指数(EAI)及乳化稳定性指数(ESI)可以表征乳状液的乳化特性及稳定状态。EAI表示乳化剂形成油-水界面的能力；ESI是指乳状液形成小液滴的抗应变能力[27]。如图4(图中不同小写字母表示乳化活性指数差异显著，不同大写字母表示乳化稳定性指数差异显著)所示，未加入EGCG时，与SPI相比，UHSPI表现出最高的EAI和ESI，可能由于碱处理产生的静电斥力与超声产生的空化作用相辅相成，使蛋白的疏水基团暴露，蛋白的二级、三级结构舒展，分子柔性增加，从而提高其乳化性[2-5]。

SPI与EGCG复合后，UHSPI-EGCG具有最高的EAI(1.98)、ESI(394.52 min)，可能是由于EGCG的加入增强界面薄膜的表面压力和黏弹性，形成较稳定的界面膜，增加复合物的EAI[10]。另外，SPI与EGCG复合后，油-水界面层一部分被蛋白质占据，另一部分被EGCG占据，形成第1层乳化膜，蛋白质的疏水基团充分暴露和EGCG通过疏水相互作用形成第2层的乳化膜，因此EAI显著提升[13]。EGCG与SPI复合后，液滴间空间斥力的增加及表面电荷的变化，导致蛋白的ESI增强[22,24]。

2.7 荧光淬灭光谱分析

通过评估EGCG对蛋白内源性荧光的淬灭情况，可分析EGCG与蛋白的结合强度[28]。如图5所示，随着EGCG浓度的不断增加，SPI和UHSPI荧光强度均逐渐降低，说明EGCG对SPI的内源荧光产生了猝灭作用[17]。同时发现SPI的最大荧光发射波长随着EGCG浓度的增加，发生了红移，且UHSPI的变化程度最为显著，这说明EGCG与SPI发生了结合，从而改变了SPI的结构构象，Trp和Tyr的微环境发生改变，由疏水环境变为亲水环境，肽链结构舒展[29]。

为评估EGCG与SPI的结合强度(图6)，根据Stern-Volmer方程计算出SPI-EGCG复合物的动态猝灭速率常数(Ksv)和双分子猝灭常数(Kq)，如表2所示，所有样品的Ksv均大于最大动态淬灭速率常数(2×1010L/(mol·s))，表明为静态淬灭[17]，另外，UHSPI具有最大的Ksv(3.094×1012L/(mol·s))，这表明EGCG与蛋白的结合强度最大，这可能是由于超声产生的空化作用及碱诱导使蛋白的疏水性基团暴露，EGCG与蛋白的疏水性结合增强[16]。

表2 SPI-EGCG复合物的荧光猝灭常数、结合位点数、表观结合常数Tab.2 Fluorescence quenching constant, number of binding sites and apparent binding constant of SPI-EGCG complex

对于静态淬灭，利用式(2)计算EGCG与SPI间的表观结合常数Ka和结合位点数n(表2)。从表2可以看出，EGCG与不同条件处理的SPI间的表观结合常数数量级为104，说明EGCG与SPI发生了紧密的结合，且均形成了结合位点数接近于1的复合物，其中，UHSPI-EGCG的结合位点数最大(1.3)，说明EGCG与其结合得最为紧密，这与上文讨论的结果一致。