基于网络药理学探讨橘皮竹茹汤治疗胃食管反流病的作用机制

王小双，魏文峰，霍金海，王伟明

(黑龙江省中医药科学院中药研究所·黑龙江 哈尔滨 150036)

橘皮竹茹汤出自于东汉末年张仲景《金匮要略·呕吐下利病脉证治》，由陈皮、竹茹、生姜、大枣、人参、甘草6味药组成，是现在临床治疗胃虚有热之呕逆的代表方剂。大量临床研究证实，橘皮竹茹汤治疗胃食管反流病具有良好的疗效[1-3]。

网络药理学的系统性、整体性的研究理念与中药复方多组分、多靶点、协同作用等特点不谋而合，国内外众多学者采用网络药理学方法对中药单味药、药对、复方治疗抑郁症、癌症、骨关节炎等多种疾病进行研究[4-6]。本文以橘皮竹茹汤治疗胃食管反流病为研究对象，运用网络药理学方法通过构建中药-成分-靶点网络，预测作用靶点，为深入探讨橘皮竹茹汤治疗胃食管反流病的作用机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 橘皮竹茹汤化学成分的整理与筛选 本课题组通过采用超高效液相色谱仪联用四级杆串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对橘皮竹茹汤的化学物质成分进行鉴别，共鉴别出化学物质成分141种。参照实验室前期体外化学成分的分析数据，整理每个化学成分的CAS号、Chamical name、InChIKey，建立橘皮竹茹汤化学成分数据库。利用TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)平台，得出每一化合物的ADME性质，选择同时满足 OB≥30%、DL≥0.18 的化学成分作为候选的活性成分。

1.2 成分作用靶点的获取 经过筛选的活性成分通过ChemDraw Ultra 12.0 软件绘制结构图，并以SDF 格式保存。分别上传至PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)服务器，获得虚拟筛选结果(前300个靶点)。利用Uniprot数据库(http: / /www.Uniprot.org /)进行标准化，得到化合物对应关键靶点的基因号。

1.3 疾病相关靶点的筛选 通过Drugbank(https://www.drugbank.ca/)数据库，以gastroesophageal reflux disease(GERD)、reflux esophagitis为检索词，获取FDA 批准的小分子治疗胃食管反流病相关药物靶点。上述检索词通过DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)分别检索 2 大数据库中与胃食管反流病相关的靶基因。最后使用Bioinformatics平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)将橘皮竹茹汤有效成分的靶点与疾病相关靶点进行拟合筛选，绘制venn图获得橘皮竹茹汤具有治疗胃食管反流病的作用靶点。

1.4 橘皮竹茹汤成分-胃食管反流靶点PPI网络构建 将橘皮竹茹汤成分与胃食管反流交集靶点提交至 STRING11.0 数据库(https://string-db.org)构建蛋白互作网络模型(PPI)，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，其余设置均为默认设置，得到PPI网络，并通过CytoScape3.6.1中MCODE插件识别PPI网络内在module，得到潜在蛋白质功能模块。

1.5 生物功能和通路分析 将筛选得到的作用靶点导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库， 对橘皮竹茹汤作用靶点进行 GO(gene ontology)富集分析以及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路富集分析。设定阈值P<0.05并按照涉及的靶点数目进行排序，筛选排名靠前的生物过程和通路，并对数据结果进行可视化。

1.6 橘皮竹茹汤处方组成-活性成分-胃食管反流靶点-通路网络图构建 运用 CytoScape3.6.1 构建橘皮竹茹汤中药-活性成分-胃食管反流靶点-通路网络图，利用 CytoScape3.6.1 内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度(Degree)、介度(BetweennessCentrality)及紧密度(ClosenessCentrality)等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

2 结果

2.1 橘皮竹茹汤活性成分 前期本课题组利用UPLC-Q-TOF-MS技术鉴别体外成分141个，通过TCSMP数据库查找每个成分的OB和DL值，根据药代动力学的方法设置 OB≥30% 和 DL≥0.18，通过OB与DL的筛选得到橘皮竹茹汤的活性成分24个，见表1。其中陈皮成分3个，甘草成分17个，竹茹成分1个，人参成分2个，生姜成分2个，大枣成分3个，竹茹和人参共有成分1个(beta-sitosterol)，甘草和生姜共有成分1个(sitosterol)，甘草和大枣共有成分2个(Mairin、quercetin)。

表1 橘皮竹茹汤中筛选的24个成分信息

2.2 橘皮竹茹汤中治疗胃食管反流病活性成分潜在靶蛋白信息 将上述24个橘皮竹茹汤活性成分通过 Pharm-Mapper分析平台进行反向分子对接实验，预测出24个化学成分的作用靶点。将所有靶点名称校正为该靶点的基因名称，共得到421个基因靶点。将DrugBank，GeneCards 和 DisGeNET 3个数据库检索得到的靶点取交集即确定为胃食管反流病相关靶点，共得到251个胃食管反流病靶点。通过韦恩图找出橘皮竹茹汤和胃食管反流病共同靶基因，共24个，见图 1。

图1 疾病靶点与活性成分靶点的匹配

2.3 橘皮竹茹汤成分-胃食管反流靶点PPI网络构建 将橘皮竹茹汤和胃食管反流病交集靶点提交至STRING11.0平台，得到橘皮竹茹汤靶点PPI网络，见图2(A)。得到PPI网络后，运Cytoscape3.6.1中的MCODE插件对蛋白相互作用关系进行分析，得到module，见图2(B)。

图2 橘皮竹茹汤-胃食管反流靶点PPI网络与module

2.4 靶点功能与通路的富集分析 为系统地阐明橘皮竹茹汤治疗胃食管反流病的多种作用机制，从生物学过程，分子功能和细胞成分3 个方面对作用靶点进行了GO富集分析，同时进行KEGG分析得到43条通路，结果见图3。结果表明，与橘皮竹茹汤靶点密切相关的生物学过程：信号转导、基因表达负调控、ERK1和ERK2级联的正调节、细胞增殖正调控和MAPK梯级等；分子功能：钙离子结合、蛋白酪氨酸激酶活性和内肽酶活性等；细胞组分：质膜、胞浆、和胞外区等。这表明橘皮竹茹汤可能通过参与上述生物过程、分子功能和细胞成分而起作用。KEGG分析结果显示，主要涉及MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、FOXo信号通路和Rap1信号通路等。将KEGG通路中去除广泛信号通路，然后将富集基因数目较多的信号通路合并，见表2。

表2 橘皮竹茹汤作用靶点KEGG信号通路

图3 橘皮竹茹汤作用靶点富集分析结果

2.5 中药-活性成分-作用靶点-通路网络构建

运用 Cytoscape 3.6.1 软件构建橘皮竹茹汤中药-活性成分-靶点-通路网络，如图 4 所示。通过 CytoScape3.6.1 内置的Network Analyzer分析橘皮竹茹汤治疗胃食管反流网络拓扑学参数，可得到主要活性成分及核心靶点。

结果表明，白桦脂酸连接度(degree)为20，介度(Betweenness Centrality)为，0.0238，紧密度 (Closeness Centrality)为0.5431，预测白桦脂酸为橘皮竹茹汤治疗胃食管反流主要成分，其次植物甾醇(连接度：20介度：0.0011紧密度：0.5431)、β-谷甾醇(连接度：19介度：0.0619紧密度：0.5338)、黄柏酮(连接度：19介度：0.0297紧密度：0.5338)，见表3。

表3 橘皮竹茹汤主要活性成分网络拓扑学参数

EGFR连接度为29，介度为0.0345，紧密度为0.6176，认为EGFR是橘皮竹茹汤治疗胃食管反流最主要的靶点，同时MAP2K1、HRAS、BRAF、ACE、ESR1、HDAC8、IGF1R是相对重要靶点。

■处方组成 ；●活性成分；◆作用靶点；富集通路图4 橘皮竹茹汤中药-活性成分-靶点-通路网络图

3 讨论

本研究通过前期的体外成分分析及TCSMP中药系统药理学分析平台按OD≥0.18，OB≥30%条件筛选出橘皮竹茹汤24个潜在活性成分，构建了中药-成分-靶点网络图，分析橘皮竹茹汤活性成分、靶点及疾病的相互作用关系。橘皮竹茹汤治疗胃食管反流病作用靶点24个。其中，细胞色素P450单加氧酶(CYP2C8、CYP2C9)是一类可以参与各种内源性底物代谢的蛋白，包括脂肪酸、类固醇激素和维生素等[7]，而同样是细胞色素P450家族的CYP2C19已有研究表明[8]，其基因的多态性对质子泵抑制剂代谢有直接影响，从而影响GERD的治疗效果，这提示我们橘皮竹茹汤可能作用于CYP2C8、CYP2C9靶点同样可以影响质子泵抑制剂代谢，从而达到治疗GERD的效果。表皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白质编码基因，与EGFR相关的疾病包括炎症性皮肤和肠道疾病等。同时研究发现[9]，病变胃黏膜组织中EGFR的蛋白表达量高于非病变胃黏膜组织，猜测橘皮竹茹汤可能是通过抑制EGFR表达达到治疗目的。橘皮竹茹汤活性成分通过上述靶点相互作用，来达到“降逆止呕，益气清热”的作用。

KEGG分析结果显示，主要涉及MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、FOXo信号通路和Rap1信号通路等。Rap1是一种小分子G蛋白，表现为有活性和无活性结合形式两种构象，它通过不同效应子抑制或激活ERK通路[10]。ERK也称丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，是一种小分子G蛋白酶，在细胞对各种应激反应中起着关键作用，参与调控细胞增殖、分化和凋亡[11]。其信号通路主要由3个亚族组成，分别是：ERK亚族、JNK亚族、P38亚族[12]。Souza RF等发现GERD患者与正常人在食管鳞状细胞的ERK1/2-MAPK表达存在显著差异[13]。胃酸反流可能激活正常食管鳞状细胞的ERK1/2，从而增加其增殖并阻止向肠型细胞分化。同时有研究表明，GERD患者胃黏膜内IL-8表达量远高于正常人[14-16]，而正常人食管上皮细胞受到胰蛋白酶刺激的同时加入MAPK抑制剂和ERK抑制剂可以降低IL-8炎症趋化因子的mRNA及蛋白表达[17]，进而恢复胃黏膜功能。橘皮竹茹汤可能通过该通路抑制IL-8因子表达和阻止食管鳞状细胞增殖与分化，从而治疗胃食管反流病。

FoxO是一种转录因子，参与细胞增殖、分化和凋亡等细胞过程[18]。FoxO家族主要受PI3K-Akt通路调控[19-20]，通过磷酸化/去磷酸化改变FoxO4的亚细胞定位[21]，而FoxO4转录因子在人类胃肠道的粘膜层腺体细胞胞浆进行表达[22]。同时，FoxO可以抑制NF-KB转录因子的活化[23-24]，NF-KB是一种参与许多炎症因子表达调控的转录因子[25]。有研究表明，胃食管反流通过NFKB介导的炎症破坏食管粘膜屏障功能[26]，而FoxO4通过作用于NF-KB转录因子对炎症因子有抑制作用，从而对组织的炎症有保护作用[27]。橘皮竹茹汤可能通过该通路抑制炎症因子的表达，在胃食管反流病的炎症免疫和发生过程方面起重要作用。

PI3K/AKT 是细胞生存中关键的调节因子，与细胞的增殖、转化、凋亡和肿瘤发生有重要作用[28]。金立鹏[29]利用HCl构建食道鳞状细胞损伤模型，发现通过上调ERK和AKT/PI3K 信号通路的活性能够减轻HCl 诱导带来的细胞损伤。同时在食管相关疾病中也发现PI3K/AKT信号通路表达异常[30]。表明PI3K/AKT信号通路与食管相关疾病密切相关。

综上所述，橘皮竹茹汤治疗胃食管反流病具有多成分、多靶点、多通路特点，利用网络药理学分析平台对橘皮竹茹汤中六味中药成分靶点及胃食管反流病疾病靶点进行预测，对后续橘皮竹茹汤治疗胃食管反流病作用机制的研究提供参考。