多指标综合评价关防风适宜干燥加工方法的研究

孙国东，王思淼，任晓蕾，霍金海，王伟明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

防风为伞形科植物防风(Schischk)未开花植物的干根，是我国常用的大宗药材之一。《本草纲目》有载：“防者防御也，因其功疗风最要，故名防风”，被历版《中国药典》收载，具有祛风解表、胜湿镇痛、止痉之功效[1]。关防风主产于黑龙江地区，内蒙古地区也有分布，属于防风中的上品；其中以黑龙江省杜尔伯特草原地区出产的小蒿子防风质量最优[2-3]。2015年本课题组制订的关防风道地药材标准ZGZYXH/T 31-2015被中国中药协会收载[4]。

药材道地性涉及种质资源、栽培技术、采收加工、包装贮藏等多个环节因素，其中采收加工方法在保证中药材质量有效性和安全性方面起到了至关重要的作用。干燥是十分常见的炮制手段，具有增强药性，降低毒性等重要作用。孙思邈《千金翼方》：“夫药采取，不依阴干、曝干，虽有药名，终无药实。”意思是应当根据药材性质来选择适合的干燥方法，这一点十分重要[5]。目前已有学者对防风干燥加工方法开展了研究工作[6-8]，但多集中于一个或几个成分的含量测定，而中药往往是通过有效组分群发挥协同作用。因此，本文采取从整体到局部，从宏观到微观的研究策略。将UV、HPLC、UPLC-Q-TOF/MS技术有机结合[9-12]，对其主要活性物质色原酮的总含量、主成分含量以及不同加工方法成分差异性进行全面分析，多指标综合评价结合确定关防风的适宜干燥加工方法。

1 材料

1.1 药物 3年生关防风采自黑龙江省绥化市庆安县大罗镇东明村(东经127°41′10.11″，北纬46°39′22.32″)，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz) Schisck的干燥根。亥茅酚苷对照品(批号：H-027-150915)、升麻苷(批号：S-004-150421)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号：J-002-150420)、升麻素(批号：S-007-150421)、欧前胡素(批号：O-001-170118)：均由成都彼斯特生物科技有限公司提供。

1.2 试剂 甲醇、乙腈：德国默克化工技术有限公司；甲酸：德国赛默飞世尔科技有限公司；超纯水：广州屈臣氏食品有限公司。

1.3 仪器 UV/VIS Lambda365型紫外-可见分光光度计：美国珀金埃尔默股份有限公司；e2695型高效液相色谱仪：Waters；Kromasil 100-5 C18(5μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱，超高效液相色谱仪：美国沃特世公司；5600+型高分辨飞行质谱仪：美国爱博才思公司；数据采集及解析工作站(Peakview、Markerview、Natural products HR-MS/MS Spectral Library)：美国爱博才思公司； UPLC BEH C18色谱柱(1.7μm，2.1 mm×10 cm)、BEH C18VanGuard Pre-Column (1.7μm，2.1 mm×5 cm)：美国爱博才思公司；KQ-300DB型超声清洗机：中国昆山市超声仪器有限公司；BSA224S型分析天平：德国赛多利斯科学仪器有限公司；S210-K型pH计：德国梅特勒-托利多仪器有限公司。

2 方法

2.1 干燥方法 ①阴干：连续在阴凉处干燥8 d，早晚各称重1 次，至含水量达到药典要求。②晒干：连续在阳光下晒干5 d，早晚各称重1次，至含水量达到药典要求。③冻干：低温冻干48 h，至含水量达到药典要求。④40 ℃烘干：40 ℃烘箱干燥约14 h，每隔2 h称重，至含水量达到药典要求。⑤60 ℃烘干：60 ℃烘箱干燥约9 h，每隔1 h称重，至含水量达到药典要求。⑥80 ℃烘干：80 ℃烘箱干燥约7 h，每隔1 h称重，至含水量达到药典要求。

2.2 总色原酮含量测定方法

2.2.1 试液的制备

2.2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取亥茅酚苷对照品4 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制备成浓度为0.08 g/L的对照品溶液，备用。

2.2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取0.2 g样品粉末， 加70%乙醇溶液25 mL，超声波震荡半小时，放至室温，称重后以相同溶剂补足损失的重量，摇匀，以微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 总色原酮含量的测定 精密吸取0.5 mL上述两种溶液，分别加水稀释至25 mL，再吸取1.0 mL加入缓冲液2.0 mL，放置30 min，加入0.7 mL显色剂，静置室温，加入2.0 mL5%NaCO3溶液，摇匀放至室温后以70℃水浴加热15 min，放冷10 min，使用紫外分光光度计在波长305 nm处扫描测定，结果见表1。

2.3 HPLC含量测定方法

2.3.1 溶液的制备

2.3.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取3-O-乙酰亥茅酚、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品0.6 mg，加入10 mL甲醇，分别配制成浓度为0.06 g/L的溶液，即得。

2.3.1.2 供试品溶液的制备 精密称取0.5 g样品粉末，加入25 mL甲醇，超声波提取1 h，放冷称重，以甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液备用。

2.3.2 色谱条件 采用 Kromasil 100-5C18色谱柱(250 mm×4.6 mm)，流动相A为水，流动相B为甲醇，梯度洗脱(0→15 min, 35% B；15→25min, 35%→55% B；25→35min, 55%B； 35→40min, 55%→100% B； 40→45min, 100%→35% B)，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL。在此条件下关防风中对照品与其他组分均能达到基线分离，结果见图1。

图1 关防风HPLC色谱图

2.4 UPLC-Q-TOF/MS分析

2.4.1 溶液的制备

2.4.1.1 对照品溶液的制备 精密称取3-O-乙酰亥茅酚、欧前胡素等对照品1 mg，加甲醇分别制成浓度为100 mg/L的溶液，即得。

2.4.1.2 供试品溶液的制备 精密称取1.0 g样品粉末，加甲醇25 mL，超声波提取1 h，放至室温，加甲醇补足损失的重量，滤过，即得。

2.4.2 色谱条件 UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×10 cm, 1.7μm)， 柱温30 ℃，流动相A为1‰甲酸-水，B为1‰甲酸-乙腈，梯度洗脱(0→10 min，95%→50%A；10→13 min，50%→30%A；13→15 min，30%→30%A；15→20 min，30%→0%A；20→20.1 min，0%→95%A；20.1→25 min，95%→95%A)，流速0.3 mL/min，每针进3μL样品。

2.4.3 质谱条件 离子源选择电喷雾质谱ESI，离子化模式包括正、负两种离子模式，正离子模式下的参数为：碰撞电压为5 500 V，离子源温度550 ℃，裂解电压为 80 V，碰撞能区间选择 20～50 eV，雾化气体及辅助气均为N2，辅助气(Gas1及Gas2)为55 PSI，气帘气(Cur Gas)为 35 PSI。负离子模式参数离子源电压为-4 500 V，其余参数与正离子模式一致。TOF MS扫描范围为80～1 500，中性离子丢失范围选择 50～1 500，并设置扣除背景。总离子流图中可见各质谱峰均能得到相对的分离，结果见图2。

图2 关防风样品TIC图

2.4.4 数据分析 (1)目标性筛查：使用质谱色谱峰处理工作站及masterview插件(美国爱博才思)加载已采集的质谱数据，使用自制质谱筛查用数据库(文献查询等方式收集127种防风药材中已知的成分所建立的化合物数据，包含分子式、分子量、名称、结构归属、植物来源及有效部位等信息)，工作站自带比对数据库模块的参数设置为：质量误差<5 ppm；分子式得分>70%；筛查方式模块选择目标筛查。 通过不同采集期内的总离子流的变化从而达到半定量的分析结论。色原酮及香豆素类成分为防风中主要成分，其特征离子碎片理论上均分布在相对固定的保留时间范围内，根据这个特点对特征离子进行扫描及筛查，可分析不同类成分相对含量的变化趋势。(2)非目标性筛查：使用质谱色谱峰处理工作站及peak finding options模块(美国爱博才思)加载已采集的质谱数据，通过将数据中所有色谱峰按照设置参数母离子强度>1000counts，信噪比>10，分子式元素筛选范围参数为C50H200O50，利用Alignment & Filtering功能降低质谱碎片与保留时间的误差，筛选出来的成分使用Marker View工作站进行降维处理，建立主成分分析模型，得到代表不同干燥方法下关防风成分离子碎片的载荷图以及代表反映各个变量对样品分型的影响的得分图。通过对比得得分图中各点与原点的距离远近表示各采集样品间的差异大小，而载荷图中各点距离原点的距离大小则表示此点所代表的成分与其他样品中与之相同的成分之间的差异大小，即与原点距离远的离子对分型贡献较大，这类化合物将作为分析的重点目标。

2.4.5 结构鉴定 通过正、负离子模式采集的质谱数据能够分别得到[M+H]+及[M-H]-碎片离子，也可得到[M+Na]+、[M+COOH]+等碎片离子，高分辨质谱能精准的获取离子碎片的精确质量数，将误差缩小在5 ppm内，此时得到的离子质量数较为精确，再计算出相应离子的同位素丰度比，进一步得到精确的分子式，通过分子式及裂解方式的推断可推测离子碎片的结构式。结构式可通过以下三种方式鉴定或推断：(1)可获得对照品，借助保留时间和二级质谱碎片比对锁定结构。(2)使用 LibraryView工作站 (美国爱博才思) 进行筛查，该数据包含了1 000余种中草药对照品的二级质谱图信息与通过解析软件筛查出的目标化合物质谱数据进行自动匹配。(3)没有对照品且工作站中没有数据的成分首先根据工作站计算其分子式，将分子式输入至chemspider的预测框中，网络数据库会给出其可能的结构式，同时计算每个二级质谱碎片的精确质量，与可能的结构式进行对比，参考同类成分文献及数据库的裂解规律进行推断，将合理的推断结构进行整理组合，从而推断化合物最终的结构。

3 结果

3.1 总色原酮含量测定结果 见表1。

表1 不同干燥方法总色原酮含量测定结果

3.2 HPLC含量测定结果 见表2。

表2 不同干燥方法HPLC含量测定结果

3.3 UPLC-Q-TOF/MS分析结果

3.3.1 模式识别分析结果 通过选用正负两种离子模式，借助PCA 分析法对实验数据进行解析，结果见图3、图4。由得分图可知，不同干燥加工方法下关防风组分具有较大的差异，说明关防风的成分会对不同干燥加工方法产生十分明显的响应。

图3 不同干燥方法关防风药材正离子PCA图

图4 不同干燥方法关防风药材负离子PCA图

3.3.2 差异性成分分析结果 共鉴定10个差异显著化合物，包括化合物名称、保留时间、分子量、扫描模式、测定误差、二级碎片等信息， 分析结果见表3。10个化合物主要为色原酮类及香豆素类化合物，以3-O-乙酰亥茅酚、欧前胡素为例介绍其典型质谱裂解规律。

表3 防风药材成分分析结果

10个化合物在不同加工方法含量发生了显著变化，其中1～3号化合物以晒干含量最高，4～6号化合物以冻干及80 ℃烘干含量较高，7号化合物以冻干含量最高，仅8号化合物以40 ℃烘干含量最高，9～10号化合物以80 ℃烘干含量最高。

香豆素类是干燥过程中变化较多的化合物，以欧前胡素为代表介绍其质谱裂解规律：

6号化合物在正离子模式下采集的离子碎片质荷比为为271.0970，与理论值比对误差仅为-1.9，经peakview工作站软件计算得到分子式为C16H14O4。由质荷比碎片离子及质谱数据库二级镜像对比图相印证后推断其裂解途径如下：准分子离子丰度比极低，高压碰撞下极易产生离子碎片203[M+H-C5H8]+，此碎片丰度比极高，为基峰碎片，其结构较为稳固，而此碎片连续脱去两分子CO分别产生两个质谱碎片175[M+H-C5H8-CO]+和147[M+H-C5H8-2CO]+；203碎片离子也能先脱一分子H2O后继续脱去一分子CO产生两个碎片离子185[M+H-C5H8-H2O]+及157[M+H-C5H8-H2O-CO]+。其二级质谱见图5，裂解途径见图5，图6。根据对照品质谱数据库及元素组成分析并参考相关文献的报道[15]，推测该化合物为欧前胡素。

图5 欧前胡素二级质谱图(A.样品；B.对照品)

图6 欧前胡素可能的裂解途径图

3.4 适宜干燥加工方法的确定

3.4.1 数据统计与分析 测定不同干燥方法各样品平所含有效成分的总量，作为适宜干燥方法确定的主要依据，结果见表4，图7。

表4 不同干燥方法关防风有效成分含量汇总表(mg/g)

图7 不同干燥方法关防风有效成分含量变化趋势图

3.4.2 适宜干燥加工方法的确定 从表4及图9可知，不同干燥方法对关防风色原酮含量影响较大，其中以晒干、冻干、60 ℃烘干、80 ℃烘干有效成分含量高，而阴干、40 ℃烘干会导致有效成分大量损失，对关防风质量影响较大。冻干成本过高，因此，建议关防风干燥方法为晒干或80 ℃烘干，产地初加工可选择晒干，规模化集约化生产则选择80 ℃烘干。

4 讨论

关防风产地初加工传统方法为晒至半干时去掉须毛，扎成小把，晒至全干[13]。现代研究报道不一致，最近研究表明，20～50 ℃中高温处理防风鲜根可显著提高药材中色原酮含量[8]

本文通过紫外分光光度法、高效液相色谱含量测定以及高分辨质谱的全面分析，可见不同干燥方法对关防风色原酮及其他成分含量影响较大，阴干及40 ℃长时间烘干会导致有效成分大量损失，可能是因为植物内源性酶在阴干及40 ℃时发挥作用，导致活性成分分解。而晒干、80 ℃烘干可有效破坏酶的活性，冻干可抑制酶的活性。因此，建议关防风干燥方法为晒干或80 ℃烘干，产地初加工可选择晒干，与传统方法一致。规模化集约化生产则选择80 ℃烘干，既提高生产效率，有提高药材指标性有效成分含量。

近年来，国内外相关学者将液相色谱法的分离管理能力和质谱的高灵敏度相结合，尤其是与高分辨质谱和多级质谱联合企业使用的技术教学手段，已广泛可以应用于中草药有效成分的全面发展分析，也为研究具有天然产物动态数据积累社会规律开辟了全新的途径。不同干燥加工方法对关防风化学成分具有明显的影响，鉴定或推断了10个对干燥方法差异贡献较大的化学成分，为全面认识加工方法对中药材化学成分的影响提供了新的研究视角，有助于全面理解中药材加工方法的重要性。