HPLC-CAD法测定硫酸卡那霉素中的硫酸盐含量

北京市药品检验所 国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室 中药成分分析与生物评价北京市重点实验室（102206）李珉 侯金凤 陆岩 车宝泉 王俊秋 李文东

卡那霉素为氨基糖苷类抗生素中具有代表性的药物之一[1]。目前卡那霉素所有制剂的原料都是以硫酸盐的形式存在，在之前的研究中发现，根据硫酸卡那霉素分子晶体结构中硫酸分子和结晶水分子个数的不同，存在多种不同的原料。目前各国药典中，主要将其区分为单硫酸卡那霉素单硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·H2SO4)和硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·xH2SO4)两种原料[2]。其中《英国药典》2017版[3]、《欧洲药典》9.0版[4]以及《日本药局方》ⅩⅦ版[5]均收录了两种原料，《美国药典》40版[6]仅收录了单硫酸卡那霉素，而《中国药典》2015年版[7]仅收录了硫酸卡那霉素。虽然各国药典均收录了至少一种硫酸卡那霉素原料，但对具体晶体结构却都没有说明。本课题组在前期研究中发现，两种原料晶体结构具有显著差异，且硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·xH2SO4)可能存在多种不同的晶体结构。因此，检查硫酸盐含量对控制分子成盐度具有重要意义，此外对区分单硫酸卡那霉素以及硫酸卡那霉素的不同晶型及晶体结构研究具有一定的借鉴意义。

附表1 回收率试验结果

附表2 硫酸盐含量测定结果

附图1 系统适用性试验色谱图

附图2 典型的对照品溶液及供试品溶液图谱

1 仪器与试药

1.1 仪器 Ultimate 3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔公司），Corona Veo 电喷雾检测器（CAD）（赛默飞世尔公司），LC-20A高效液相色谱仪（岛津公司），2000ES蒸发光散射检测器（ELSD）（奥泰公司），X A 2 0 5 电子天平（梅特勒-托利多公司）等。

1.2 对照品 卡那霉素对照品（批号130556-200501，含量6 6.5%）和卡那霉素B 对照品（批号130548-200501）均购自中国食品药品检定研究院，硫酸滴定液（批号20161103）由北京市药品检验所配制并标定。

1.3 试剂 三氟乙酸、甲醇均为色谱纯，购自Merck公司。

1.4 样品 单硫酸卡那霉素原料，分别来自本溪海大制药有限公司（企业A）和古田福兴医药有限公司（企业B）；硫酸卡那霉素原料，来自成都倍特药业有限公司（企业C）。

2 实验方法及结果

2.1 HPLC-CAD条件 色谱柱：Waters HSS T3色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相：0.2mol/L三氟乙酸水溶液；流速：0.3mL·min-1；柱温：30℃；进样体积：20μL。

喷雾器温度：3 5 ℃；采样频率：1Hz；输出范围：100pA；氮气工作气压：58.7psi。

2.3 系统适用性试验 分别称取卡那霉素对照品12.37mg，卡那霉素B对照品8.42mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。精密量取系统适用性试验溶液20μL注入液相色谱仪，照“2.1”项下条件分析，结果见附图1。

硫酸根离子峰与卡那霉素峰分离度达到10.55，卡那霉素峰与卡那霉素B峰分离度达到6.65，硫酸根离子峰理论塔板数为5432，满足分析要求。

2.4 检出限与定量限 量取硫酸滴定液适量，加水溶解并逐级稀释得系列稀释溶液，按信噪比为3∶1测定检测限为0.02μg，按信噪比10∶1测定定量限为0.04μg。

2.6 进样精密度 精密量取硫酸滴定液0.8ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为硫酸盐进样精密度试验。取“2.4项”下硫酸盐进样精密度溶液，重复进样6次，以峰面积计算，RSD为0.6%，进样精密度良好。

2.7 重复性 取批号为（20120112-1）样品，分别精密称取6份，分别照硫酸盐测定方法，分别进样，测定其硫酸盐含量，结果的RSD为0.8%。

附图3 硫酸盐（SO42-）对照溶液、亚硫酸盐（SO32-）对照溶液以及硫酸卡那霉素注射液供试品溶液图谱

2.8 回收率 取批号为20120112-1的样品约12.5mg，置50mL量瓶中，加入硫酸滴定液0.4mL，重复配制6份，作为硫酸盐回收率试验溶液。计算回收率结果见附表1，结果满足硫酸盐分析要求。

2.9 硫酸盐测定 分别取批号为20120112-1、20120203-1、D1405020和D1405022的单硫酸卡那霉素原料样品以及批号为100701、130701和131001的硫酸卡那霉素原料样品，按“2.2”项下方法配制供试品溶液及对照品溶液，照“2.1”项下条件分析。典型的对照品溶液及供试品溶液代表图谱，详见附图2。采用标准曲线法计算硫酸盐含量，结果见附表2。

3 讨论

由硫酸盐测定结果可以看出，单硫酸卡那霉素与硫酸卡那霉素两种原料所含硫酸盐含量显著不同。目前《中国药典》2015年版中收载了硫酸卡那霉素原料，其硫酸盐含量的限度为按干燥品计算的23.0%～26.0%，《美国药典》40版中收载了单硫酸卡那霉素，其硫酸盐含量的限度为按干燥品计算的15.0%～17.0%。采用建立的HPLCCAD法，两种原料药测定结果分别在15.0%～17.0%和23.0%～26.0%范围内，这也从侧面印证了两种原料具有不同的分子组成，为两个不同的药品品种。

综上所述，本文建立了用于测定硫酸卡那霉素原料药中硫酸盐含量的HPLC-

CAD法，以代替现行标准中的容量滴定法。高效液相色谱法相较容量滴定法具有专属性强、分离度高的优势。同时，CAD检测器可以弥补传统紫外检测器对硫酸盐测定不适用的问题。新建的HPLC-CAD法结合了专属性强的分离能力以及灵敏度高的检测能力，可以更有效地进行硫酸盐测定。此外，新建的HPLC-CAD法还具有用于其他氨基糖苷类抗生素原料药中硫酸盐含量测定的潜力。