生长激素改善GnRHa干预后性早熟大鼠生长减速的作用机制

章建伟 张涛 吴满武

中枢性性早熟（central precocious puberty，CPP）由于下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamus pituitary-gonad axis，HPGA）过早启动，发育年龄提前，骨骺提前闭合，将影响患儿的最终成年身高，给家长和患儿带来严重的心理影响和社会影响［1］。促性腺激素释放激素类似物（gonadotrophin releasing hormone analogue，GnRHa）能有效抑制HPGA 轴的活动、减缓骨龄进展、改善最终成年身高［2］。然而，临床上有相当部分患儿应用GnRHa治疗后出现生长减速，甚至生长停滞，最终成年期身高改善不理想［3-4］。目前临床上部分医生采用GnRHa 和重组人生长激素（Recombinant Human Growth Hormone，rhGH）联用治疗CPP 克服生长减速，但其确切机制尚未阐明［5-6］。本研究利用生长激素治疗GnRHag 干预后性早熟大鼠，观察软骨生长板变化，来探究联合应用rhGH 和GnRHa 治疗中枢性性早熟生长减速的机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立 48 只5 日龄的SFP 级雌性SD 大鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，由浙江中医药大学动物实验研究中心大小鼠繁殖饲料（批号P1100-20200511006）饲养。随机分为8 组，每组各6 只。A：正常大鼠对照组，B：性早熟大鼠模型组，C：GnRHa 1000 μg/kg，D：GnRHa 800 μg/kg 给药组，E：GnRHa 600 μg/kg 给药组，F：rhGH+GnRHa 600 μg/kg 给药组，G：rhGH+GnRHa 800 μg/kg，H：rhGH+GnRHa 1000 μg/kg 给药组。模型组与给药组大鼠于5 日龄时皮下注射300 μg 达那唑溶液，溶解于25 μl 乙二醇/乙醇（1 ∶1）混合液。出生后25 天开始每天检查阴道开口情况，直至大鼠建立正常的性周期。给药组大鼠分别给予GnRHa 制剂曲普瑞林，2 周强化治疗1 次，4 周末时对联合给药组（FGH 组）大鼠加用rhGH 制剂［1 IU/（kg·d）］，8 周末时结束。

1.2 检测指标 （1）体征观察：自造模起每周用游标卡尺测量一次大鼠的体重、鼻尾长、胫骨长，连续8 周。大鼠胫骨组织切片观察大鼠胫骨样本置入4%多聚甲醛溶液中，24 h 后锯取0.5 cm 骨片，经过脱钙，脱水、石蜡包埋、冷冻切片，制成4 μm 石蜡切片，用于HE染色，通过显微镜拍照，观察和分析样本。（3）IGFR1、FGF2 和FGFR3 蛋白表达量检测：采用Western Blot 的方法半定量检测蛋白表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，组间两两比较，方差齐性者采用两独立样本t检验，方差不齐者采用Kruskal-Wallis H 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体重、鼻尾长和胫骨长测量 根据表1 可得，给药8 周后，rhGH+GnRHa 1000 μg/kg 与rhGH+GnRHa 800 μg/kg 大鼠的体重、鼻尾长度和胫骨长度均显著上升（P＜0.01），GnRHa 600 μg/kg 组与GnRHa 800 μg/kg 组仅有胫骨长度显著上升（P＜0.01 或P＜0.05）。就体征指标的改善效果来看，药物效果由大到小分别为：rhGH+GnRHa 1000 μg/kg＞rhGH+GnRHa 800 μg/kg＞rhGH+GnRHa 600 μg/kg≥GnRHa 1000 μg/kg ＞GnRHa 800 μg/kg＞GnRHa 600 μg/kg。

表1 给药8周性早熟大鼠体重变化（±s，n=6）

表1 给药8周性早熟大鼠体重变化（±s，n=6）

注：与性早熟大鼠模型组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与正常雌性大鼠对照组比较，▲P＜0.01

组别 体重（g） 鼻尾长（cm） 胫骨长（cm）rhGH+GnRHa（600 μg/kg）组 196.35±20.06 41.73±1.42* 35.55±0.97#rhGH+GnRHa（800 μg/kg）组 207.32±21.63* 42.47±1.10# 35.7±1.16#rhGH+GnRHa（1000 μg/kg）组 211.62±20.21# 43.33±1.92# 35.82±1.30#GnRHa（600 μg/kg）组 185.12±18.84 40.77±1.86 34.40±0.85*GnRHa（800 μg/kg）组 190.32±20.14 41.00±1.54 34.90±1.23#GnRHa（1000 μg/kg）组 195.35±21.09 41.62±1.72* 35.28±1.09#性早熟大鼠模型组 178.80±19.23 ▲ 39.48±1.81 ▲ 32.97±1.00 ▲正常雌性大鼠对照组 214.08±22.46 43.77±1.11 36.67±0.82

2.2 血清IGF-1 含量变化情况 给药8 周后，空白组IGF-1 含量为（388.10±39.73）ng/L，模型组大鼠IGF-1含量为（240.12±25.64）ng/L，两组大鼠血清IGF-1 含量有显著差异（P＜0.01）。rhGH+GnRHa（1000 μg/kg）组大鼠IGF-1 含量为（366.01±36.31）ng/L，GnRHa（1000 μg/kg）组大鼠IGF-1 含量为（305.89±30.80）ng/L，与模型组大鼠相比有显著上升（P＜0.05）。

2.3 HE 染色观察药物对性早熟大鼠胫骨影响 根据图1 可得，正常雌性大鼠对照组胫骨细胞形态正常，排列紧密，软骨层厚度适宜，无软骨脱失现象，骨小梁结构与形态紧密正常。性早熟大鼠模型组胫骨细胞破坏严重，甚至出现大面积脱落，骨小梁稀疏碎裂，结构紊乱。与性早熟大鼠模型组相比，给药组大鼠细胞破坏程度较轻，细胞形态较为正常。细胞破坏程度由低到高为：rhGH+GnRHa 1000 μg/kg＞rhGH+GnRHa 800 μg/kg＞rhGH+GnRHa 600 μg/kg＞GnRHa1000 μg/kg＞GnRHa 800 μg/kg＞GnRHa 600 μg/kg。

图1 性早熟大鼠胫骨HE染色图（×200）

2.4 Western Blot 检测软骨组织蛋白表达水平 根据图2可得，与对照组相比，模型组大鼠软骨组织中的FGF2、FGFR3、IGF-1R 蛋白表达水平极显著下降（P＜0.01）。与性早熟大鼠模型组相比，rhGH+GnRHa 600 μg/kg 组、rhGH+GnRHa 800 μg/kg 组、rhGH+GnRHa 1000 μg/kg组软骨组织中的FGF2、FGFR3、IGF-1R 蛋白表达水平均极显著上升（P＜0.01），且与给药剂量呈正相关。GnRHa 1000 μg/kg 组 的FGF2、FGFR3、IGF-1R 蛋白表达水平显著上升（P＜0.01 或P＜0.05）；GnRHa 800 μg/kg 组的软骨组织仅有FGF2 与IGF-1R 的蛋白表达水平显著上升（P＜0.01 或P＜0.05），FGFR3 则仅有上升趋势而无显著性（P＞0.05）；而GnRHa 600 μg/kg组大鼠软骨组织只有FGF2 的蛋白表达水平显著上升（P＜0.05），其余均无显著性变化（P＞0.05）。

图2 软骨组织中FGF2、FGFR3、IGF-1R蛋白条带图与蛋白表达水平

3 讨论

中枢性性早熟是儿童常见的内分泌疾病，其发病率在1/5000～1/1000，女童高于男童［7］。GnRHa 是中枢性性早熟一线治疗药物，但是部分CPP 患者在GnRHa治疗中因无法克服生长减慢而影响成年身高的改善，失去继续使用GnRHa 治疗的意义，有60%的患儿未能达到靶身高［7］。国内马华梅等［8］对已接受GnRHa 治疗＞6 个月、治疗中生长速度显著减慢的15 例CPP 女孩联用一定疗程的rhGH 治疗，结果发现联用rhGH 能显著加快GnRHa 治疗中生长过慢的CPP 女孩的生长速度，推迟骨骺闭合以及改善预测成年身高。王春林等［9］对2012～2013 年就诊的80 例CPP 女童进行回顾性分析发现，联用rhGH 成年身高得到明显改善。

性早熟以女童多见，故本研究采用雌性SD 大鼠建立的性早熟大鼠模型并给药，结果发现，GnRHa 不同剂量组大鼠的鼻尾长度和胫骨长度优于性早熟模型组，GnRHa 与rhGh 联合给药组明显优于GnRHa 单用组。GnRHa 与rhGh 联合组血清中胰岛素样生长因子IGF-1含量上升，胫骨组织切片细胞形态和排列更正常，提示GnRHa 与rhGH 联合组大鼠鼻尾长度和胫骨长度较好可能与IGF-1 及胫骨软骨板局部作用有关。

国外研究报道指出GH 可刺激肝细胞等产生IGF-1，刺激软骨生长板的静息区软骨细胞增殖，促进骨骼生长。IGF-1 可刺激骺板软骨细胞增殖，促进胶原及硫酸粘多糖合成，IGF-1 亦参与蛋白质代谢的调节，从而介导GH 促骨纵向生长作用［10-12］。GH 还可以刺激软骨细胞IGF-1 受体表达促进软骨生长。亦有研究报道，对胫骨IGF-1 受体基因敲除的大鼠予rhGH 刺激后，大鼠胫骨仍能正常生长，提示生长激素刺激软骨生长并不完全依赖GH-IGF-1 调控系统［13］。FGF-2 是FGFs 超家族的主要成员，具有促进纤维细胞增殖的作用，其在生长板软骨细胞生长中也起重要调节作用。FGF2 与IGF-1 有协同作用，可促进软骨增殖。FGF2 主要通过FGFR3 促进软骨增殖。观察胫骨软骨面中IGF-1R、FGF2、FGFR3 等蛋白表达情况，作者认为联用rhGH联合GnRHa 治疗性早熟大鼠生长减速的作用机制与IGF、IGF-1R、FGF2、FGFR3 蛋白的相互作用和信号介导有关。