黑曲霉DR12 菌株固体产酶发酵条件优化及菌剂制备

张育铭，孙卓楠，王 勇，郭洁心，张宝俊

（山西农业大学植物保护学院，山西太谷 030801）

农作物秸秆是农业生产中产生的一类富含有机质、具有多用途的可再利用生物质资源。开展秸秆还田再利用，可减少秸秆污染、改善土壤结构、增加田间肥力，使农作物获得增产。农作物秸秆由大量的有机物和少量的无机物及水组成，其有机物的主要成分为纤维素类物质。纤维素的降解需要一系列细胞壁降解酶（cell wall degradingenzymes，CWDEs）的水解、裂解等催化反应。土壤或其他生境中存在多种假单胞杆菌、芽孢杆菌、木霉菌、青霉菌、黑曲霉及放线菌中的诺卡氏菌等[1-3]，它们可产生内切-β-1，4 葡聚糖酶（Cx）、外切-β-1，4 葡聚糖酶（C1）、β-1，4 葡萄糖苷酶等一种或多种纤维素酶，促进秸秆纤维素的降解[4-6]。因此，高效降解菌的筛选和发酵条件的优化，是提高菌株生物量、提高秸秆降解率，加速生物转化过程的基础。李林超等[7]从玉米秸秆堆肥中分离到多株均具有纤维素酶活性、滤纸酶活性和木聚糖酶活性的高效降解纤维素的菌株。崔秀秀等[8]对1 株耐冷纤维素降解细菌HQ 产内切纤维素酶的发酵条件进行优化，最终确定发酵条件是30 g/L CMC-Na 为碳源、40 g/L 1∶1 牛肉膏-蛋白胨为氮源、0.11%吐温-80 为促进因子、pH 值5.35、温度40 ℃、接种量为6.42%时效果最优，可使内切β-1，4 葡聚糖酶活达到32.5 U/mL，比优化前提高2.96 倍。郑国香等[9]对1 株奥尔森青霉菌L-11 的产酶条件进行优化，产酶最优条件为麸皮11.05g/L、豆粉2.32 g/L、初始pH 值5.23、卵磷脂2.30 g/L，可使其羧甲基纤维素酶活（CMCase）达48.809 U/mL。

黑曲霉DR12 菌株是山西省植物内生菌服务共享平台从山西省太谷县富含腐殖质的农田土壤5～10 cm 处采集并分离的1 株具有纤维素降解酶活性的纤维素降解菌，为充分发挥该菌株的产酶活性，分别通过单因素试验和正交试验对其营养条件、发酵条件和助剂添加量进行优化，并制备微生物菌剂，旨在为纤维素降解菌的开发应用奠定一定的基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料及试剂

黑曲霉DR12 菌株由山西省植物内生菌服务共享平台保藏并提供。

PDB 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 000 mL，pH＝7。

固体发酵培养基：NaCl 0.1 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeCl30.01 g，秸秆纤维素20 g，pH＝7。

3，5 二硝基水杨酸（DNS）、苯酚、硫酸铵等试剂购自上海生工工程有限公司。

1.2 单因素试验

以固体发酵培养基为基础培养基，分别使用谷子秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、麦麸及玉米芯作为该培养基的碳源，在PDB 液体培养基中接种DR12 菌株培养3 d，取2 mL 作为发酵液接种于固体发酵培养基上，在含水量为60%、30 ℃条件下恒温培养10 d，通过DNS 法[10]测定各处理组滤纸酶（FPA 酶）活性，分析不同碳源对DR12 菌株产酶活力的影响。同样最佳氮源的筛选分别以硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵、豆粕、尿素作为基础培养基的氮源，其他条件同最佳碳源的筛选。各进行3 次重复。

1.3 正交试验

1.3.1 最佳发酵条件筛选 将温度、含水量、pH、接种量、N%作为发酵条件试验因素，建立5 因素3 水平的正交试验（表1），培养10 d 后采用DNS 方法[10]测定FPA 酶的活力，以筛选出最佳的发酵条件。

表1 发酵条件筛选正交试验的因素与水平

1.3.2 最佳助剂添加量筛选 使用1.3.1 筛选出的最佳产酶发酵条件，建立以中微量元素、表面活性剂、保水剂、生物酶制剂作为助剂的4 因素3 水平正交试验（表2），筛选最佳助剂添加量。

表2 助剂添加量筛选正交试验的因素与水平

1.4 DR12 腐熟菌剂的制备及活性测定

将菌株接种到PDB 液体培养基中培养制成菌液，在前面试验的基础上将各配方按照筛选出的最佳条件加入固体发酵培养基中，将其置于恒温恒湿条件下培养10 d。采用GB 20287—2006 农用微生物菌剂标准[11]，测定所制备菌剂有效活菌数、纤维素酶活、含水量、pH 值等，对其质量进行评测。

1.5 数据分析

本试验采用Excel 2019 和SPSS 22.0 软件进行数据分析和显著性差异检验。

2 结果与分析

2.1 不同碳源和氮源对DR12 菌株滤纸酶活力的影响

由图1 可知，5 种碳源的滤纸酶活力在6.75～11.12 U/mL，其中，以谷子秸秆、玉米芯为碳源时，滤纸酶活性分别为11.12、9.83 U/mL，与其他处理组差异显著。因此，谷子秸秆为最优碳源。

由图2 可知，5 种氮源的滤纸酶活力在12.27～20.89 U/mL，由大到小依次为硫酸铵＞硝酸钠＞硝酸铵＞尿素＞豆粕，其中，硫酸铵、硝酸钠为氮源时，滤纸酶活力分别为20.89、19.38 U/mL，与其他处理间差异显著。因此，硫酸铵适合作为菌剂发酵产酶培养基的氮源。

2.2 不同发酵条件对DR12 菌株滤纸酶活力的影响

由表3 分析可知，影响DR12 菌株分泌滤纸酶发酵水平主次因素依次为：温度＞初始pH＞含水量＞N＞接种量，通过正交试验分析结果，可得出菌株生长活性和产酶活性最优组合为A1B1C1D1E3，即含水量为40%、温度为25 ℃、初始pH 值5、接种量为1.5 mL、N 为0.8%时，最有利于滤纸酶活力的提高。

表3 不同发酵条件筛选正交试验结果

2.3 不同助剂添加量对DR12 菌株滤纸酶活力的影响

表4 助剂添加量筛选正交试验结果

从表4 可以看出，影响DR12 菌株产酶活性的主次因素依次为：中微量元素＞保水剂＞表面活性剂＞生物酶。交互作用最优组合为A1B2C2D3，即DR12 腐熟菌剂的最佳助剂添加量为中微量元素0.5 mL/L、保水剂2%、表面活性剂1%、生物酶3 mL/L。

2.4 DR12 腐熟菌菌剂及活性

制备的DR12 腐熟菌菌剂有效活菌数含量为7.5×108cfu/g，纤维素酶含量63.39 U/g，含水率为27%，pH 值为6.4，各项质量指标均符合国家标准。

3 结论与讨论

秸秆腐熟剂能够提高秸秆的腐熟速度和腐熟度[12]，使秸秆中的养分充分分解，释放为易被植物吸收利用的简单有机物，以提高秸秆利用率。王水顺等[13]对黑曲霉的固体发酵条件研究表明，（NH4）2SO4对菌株的产酶活性有很好的促进作用，且在最佳发酵条件下，菌株产纤维素酶提高。王加友等[14]利用以玉米秸秆纤维素为唯一碳源的固体分离培养基，获得1 株产纤维素酶能力较强的真菌SY-403，对其所产纤维素酶酶学性质进行初步研究，结果表明，该酶最适反应pH 值为6.0、温度为20 ℃。本研究在最优发酵条件下，通过对表面活性剂、中微量元素、生物酶等添料进行了最优条件筛选，并制得含DR12 菌株微生物的生物菌剂，测得菌剂各项质量指标均符合国家行业标准，与辛银川[15]所制备菌剂检测指标相近。下一步将进行DR12 菌剂对谷子秸秆的降解效率及腐解物中腐殖质、胡敏酸等有机质含量的研究。