绿色富硒生物猪饲料中AFB1 达标生产工艺优化研究

郑 威， 卢 婵， 余 侃， 黄思思， 余锦平 ， 刘金龙 ， 程水源，魏金涛， 李良华， 刘欋霄， 郑 倬， 田国政， 周光来

（1.湖北省农业科学院农业经济技术研究所，湖北武汉430064；2.湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北恩施445000；3.武汉轻工大学国家富硒农产品加工技术研发专业中心，湖北武汉430023；4.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉430064；5.湖北华龙西科生物科技有限公司，湖北英山438700）

黄曲霉毒素（AFB1）是饲料中毒性最为强烈的毒素成分，其破坏机体免疫机能，降低生猪疾病的抵抗能力和生长速度。 AFB1蓄积在猪肉中，降低了猪肉安全性和品质，损害人和动物的肝脏，甚至引起动物癌变致死（周芬等，2019a、2019b；张帆等，2018）。 生猪饲料在原料生产和储放过程中易被黄曲霉侵染。 我国GB 13078-2001 规定仔猪配合饲料及浓缩饲料和生育肥猪、种猪配合饲料及浓缩饲料的AFB1最高限量分别是10、20 μg/kg，有研究证明饲料存放35 d，AFB1含量为20.8 μg/kg，超过浓缩料毒素限量标准， 甚至最高达到239.97 μg/kg（白龙律等，2020；姜翠翠等，2008）。

目前已有用益生菌（李雯等，2020； 彭俊等，2020； 张 波，2020；Chang 等，2020； 胡 永 婷 等，2019；杨桂林等，2019；张铭，2019）、臭氧（Torlak等，2016）、低温射频等离子体（李玉鹏等，2014）、常压等离子体（任翠荣等，2017）、超高压辅助酶法（林奕云等，2019）、辐照（王守经等，2015）、微波（靳志强等，2011）、脉冲强光、紫外和红外辐射（王蓓等，2014）等技术分别对降解AFB1进行了小试研究报道，但都没有进入中试批量生产。本研究使用先进的中试固体发酵系统设备和益生菌发酵技术进行单因素设计试验， 并采用响应面分析软件优化发酵降解猪饲料AFB1最佳生产工艺参数，旨在形成比较成熟的猪饲料AFB1达标中试生产线和生产技术，再经过大生产前的生产参数调试，满足大中小养猪场机械化、 低成本生产AFB1达标的猪饲料。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与材料

1.1.1 仪器设备 T200 型固体发酵罐体系统设备（上海洋格生物工程设备有限公司）、JC-280 量子波发生器（中健量子科技有限公司）、TS-211GZ摇床、DN900×1500 mm 高压锅、SW-CJ-1F 超净工作台、OZ-2003 臭氧机、1290-6530 生化-63-液相-质谱联用仪。

1.1.2 材料 益生菌1 号菌CCTCC NO.M2016298，2 号 菌CGMCC NO.17328，3 号 菌CGMCC NO.15611， 供试饲料为市售配合饲料，AFB1标准品（北京毕特博生物技术有限责任公司）， 纯度99.9%亚硒酸钠（无机硒，Se4+，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 AFB1含量分析方法 使用1290-6530 生化-63-液相-质谱联用仪， 按NY/T 2017 检测要求检测AFB1含量。

1.3 数据处理软件 单因素数据处理软件Origin8.5，响应面数据处理软件Design-expert V8.0.6。

1.4 单因素发酵降解AFB1工艺设计

1.4.1 硒浓度对降解AFB1量的影响 配制AFB1浓度为60 μg/kg 的牛肉膏液体培养基2 L， 置灭菌小试用发酵罐，设置发酵温度32 ℃，1 号菌种，量子波强度15 Hz，发酵时间24 h，硒浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/kg，接菌种发酵培养。1.4.2 发酵时间对降解AFB1量的影响 配制AFB1浓度为60 μg/kg 的牛肉膏液体培养基2 L，置灭菌小试用发酵罐， 设置发酵温度32 ℃，1 号菌种，量子波强度15 Hz，硒浓度0.3 mg/kg，设置发酵时间分别为0、3、6、9、12、15、18、21、24 h，接菌种发酵培养。

1.4.3 量子波强度对降解AFB1量的影响 配制AFB1浓度为60 μg/kg 的牛肉膏液体培养基2 L，置灭菌小试用发酵罐， 设置发酵温度32 ℃，1 号菌种，硒浓度0.3 mg/kg，发酵时间24 h，量子波强度分别为0、5、10、15、20、25、30、35 Hz，接菌种发酵培养。

1.4.4 菌种组合对降解AFB1量的影响 配制AFB1浓度为60 μg/kg 的牛肉膏液体培养基2 L，置灭菌小试用发酵罐，设置发酵温度32 ℃，硒浓度0.3 mg/kg，量子波强度15 Hz，发酵时间24 h，设置菌种分别为0 号菌种 （无菌种）、1 号菌种、2号菌种、3 号菌 种、1 号菌种+2 号 菌种组合、1 号菌种+3 号菌种组合、2 号菌种+3 号菌种组合、1号菌种+2 号菌种+3 号菌种组合，接菌种发酵培养。

1.5 响应面法降解AFB1量工艺 根据单因素试验结果，以硒浓度、发酵时间、量子波强度和菌种组合为自变量， 饲料含AFB1量为响应值， 根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理， 采用响应面法在四因素三水平下对发酵工艺参数进行优化（表1）。 根据模型分析试验结果，确定最佳降解AFB1量的工艺条件。

表1 响应面设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素对降解猪饲料AFB1量的影响

2.1.1 硒浓度对降解猪饲料AFB1量的影响 猪饲料原料AFB1量为60.15 μg/kg，经过量子波处理和益 生菌CCTCC NO.M2016298 发酵，AFB1量降解至26.05 μg/kg（图1）。依次加入亚硒酸钠的纯硒0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/kg， 猪饲料AFB1量逐步降低。 说明硒具有增强益生菌降解AFB1的效果。 但随着加硒量增加，猪饲料AFB1量减少不显著，当硒浓度达到0.4 mg/kg 后， 再增加硒浓度， 其猪饲料AFB1量不再减少。 推测无机硒（Se4+）在降解AFB1的量时有一个临界值，超过这个临界值，再增加硒浓度，AFB1不再降解。 说明使用硒浓度0.4 mg/kg时，可最大限度促进枯草芽孢杆菌发酵活性和发挥其最大的降解猪饲料AFB1的能力。

图1 硒浓度对降解猪饲料AFB1 量的影响

2.1.2 发酵时间对降解猪饲料AFB1量的影响猪饲料原料AFB1量为60.15 μg/kg， 经过量子波处理、接种益生菌CCTCC NO.M2016298，逐步增加发酵时间， 猪饲料AFB1量依次降解至58.93、54.98、48.85、40.67、31.37、14.16、12.42、12.07 μg/kg，增加发酵时间可显著降解猪饲料AFB1量（图2）。当发酵21 h 后，再增加发酵时间，降解AFB1效果不明显，这与枯草芽孢杆菌在发酵21 h 左右结束发酵的微生物种性有关。

图2 发酵时间对降解猪饲料AFB1 量的影响

2.1.3 量子波强度对降解猪饲料AFB1量的影响添加硒浓度0.3 mg/kg， 用益生菌CCTCC NO.M2016298 发酵24 h，随着量子波强度增加，猪饲料AFB1量逐步降低，使用量子波处理后，猪饲料AFB1量降低28.49 μg/kg。 在5 ～30 Hz 内，随量子波强度增大，猪饲料AFB1量显著降低，量子波强度高于35 Hz，则猪饲料AFB1含量不降反而略升（图3）。 推测量子波强度低于30 Hz，可充分激活枯草芽孢杆菌降解猪饲料AFB1的能力； 量子波强度高于35 Hz， 则抑制枯草芽孢杆菌降解AFB1的能力。

图3 量子波强度对降解猪饲料AFB1 量的影响

2.1.4 菌种组合对降解猪饲料AFB1量的影响分别接种0 号菌种（无菌种）、1 号菌种、2 号种菌、3 号菌种、1 号菌种+2 号菌种组合、1 号菌种+3 号菌种组合、2 号菌种+3 号菌种组合、1 号菌种+2号菌种+3 号菌种组合进行发酵。加入益生菌后的猪饲料AFB1量明显降低。 2 号菌种+3 号菌种组合降解猪饲料AFB1量的效果最明显。1 号菌种+2号菌种+3 号菌种组合其次（图4）。 说明不同的枯草芽孢杆菌种和不同的枯草芽孢杆菌种组合发酵降解猪饲料AFB1有较大差异， 推测与某些菌种间存在拮抗有关。

图4 菌种组合对降解猪饲料AFB1 量的影响

猪饲料原料AFB1量为60.15 μg/kg，0 号菌种（不接菌种）处理的猪饲料AFB1量比未发酵前提高了9.71 μg/kg，这说明，只有硒、量子波而没有益生菌存在下，随着时间的推移，猪饲料AFB1量略有提高，因此有效降低AFB1超标猪饲料必须使用具有显著降解AFB1能力的益生菌，结合硒、量子波、发酵时间等因素协同增强降解AFB1的效果。

2.2 响应面试验设计及结果 在单因素试验结果基础上，以硒浓度、发酵时间、量子波强度和菌种组合为自变量，猪饲料含AFB1量为响应值，进行响应面分析试验。 试验结果如表2 所示。

2.3 响应面回归模型及方差分析 根据表2 进行多元回归拟合和方差分析，结果如表3 所示。

四个因素经过拟合的二次多项回归模型方程为：Y =24.37 -0.69A -20.79B -9.64C -2.81D -0.92AB +0.11AC +0.038AD -4.88BC -0.31BD +4.88CD+0.18A2+13.59B2-3.64C2-2.26D2。 模型P＜0.0001，具有高度的显著性，模型失拟项P=0.088＞0.05，不显著，证明建模成功，试验结果可用该模型描述。 模型的决定系数R2=0.9796，说明响应值的变化有97.96%来源于所选因素，该模型与实际情况接近，试验拟合程度良好，误差小，能充分反映各因素与响应值间的关系。

发酵时间、量子波强度的一次项，发酵时间的二次项达到极显著水平（P＜0.0001）；菌种组合的一次项、量子波强度的二次项、量子波强度与菌种组合的交互作用和发酵时间与量子波强度交互作用达到显著水平（P＜0.05）；说明各因素对响应值的影响较为复杂，不是简单的线性关系，而应是抛物面关系。 根据各因素F 值的大小可知，各因素对降解猪饲料AFB1量的能力影响的大小顺序为：发酵时间＞量子波强度＞菌种组合＞硒浓度。

2.4 因素间交互作用分析 响应曲面坡度越弯曲，则响应值对于因素的改变越敏感，相反曲面越平缓，则响应值对于因素的改变越迟钝；等高线图形状反映交互作用的强弱， 等高线图形越椭圆，表示交互作用越显著。 图5 ～图10 直观地给出了各个因素交互作用响应面的3D 和等值线分析图。从图上可知，BC、CD 即发酵时间与量子波强度、 量子波强度与菌种组合交互项对响应值的影响显著， 这与模型的方差分析结果一致。

2.5 最佳工艺条件 根据拟合模型方程，结合等高线和响应面，得出降低猪饲料AFB1量的最佳发酵工艺参数为：硒浓度0.3 mg/kg，发酵时间20 h，量子波强度30 Hz 和2 号菌CGMCC NO.17328与3 号菌CGMCC NO：15611 组合，可将猪饲料中的AFB1从63.41 μg/kg 降解到2.98 μg/kg， 降解率达到95.30%。

2.6 产品质量指标

2.6.1 感官指标 发酵猪饲料，没有异味。

2.6.2 微生物指标 枯草芽孢杆菌和芽孢杆菌≥1×106cfu/mL，霉菌、酵母菌、致病菌未检出，符合GB/T 4789.35-2016 相关要求。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型及方差分析

图5 硒浓度和发酵时间交互作用的等高线图与响应面

图6 硒浓度和量子波强度交互作用的等高线图与响应面

图7 硒浓度和菌种组合交互作用的等高线图与响应面

图8 发酵时间和量子波强度交互作用的等高线图与响应面

图9 发酵时间和菌种组合交互作用的等高线图与响应面

图10 量子波强度和菌种组合交互作用的等高线图与响应面

3 结论与讨论

本试验结果表明， 影响降解猪饲料AFB1量的因素大小顺序为：发酵时间＞量子波强度＞菌种组合＞硒浓度。 优化的降解猪饲料AFB1量的最佳工艺条件为：硒浓度0.3 mg/kg，发酵时间12 h，量子波强度30 Hz 和菌种组合益生菌CGMCC NO：17328 混合CGMCC NO：15611。 可将猪饲料AFB1量从63.41 μg/kg 降解到2.98 μg/kg，降解率达到95.30%。 量子波强度与菌种组合的交互作用和发酵时间与量子波强度在降解AFB1的交互作用达到显著水平。发酵时间和量子波强度在降解AFB1达到极显著水平。

在本研究响应面里，3 种菌种组合既是3 个水平又是3 个因素，不同菌种、不同菌种组合，降解AFB1的效果不同，不同菌种组合降解AFB1的叠加效果差异较大，略有影响变异系数，但证明不同益生菌组合降解AFB1效果有差异。 在本研究响应面里， 无机硒 （Se4+） 可提高益生菌活性，从而提高降解猪饲料AFB1的效果，但达不到显著水平。