美洲大蠊提取物抗氧化活性研究

和 英，顾 婷，杨永寿，肖培云

（大理大学药学院，云南大理 671000）

蜚蠊入药有悠久的历史，初见于《神农本草经》，列为中品，其味咸、性寒，治血瘀，能破积聚〔1〕。现代供药用的蜚蠊为人工养殖的美洲大蠊（Periplaneta americana），为自然界中分布极广的节肢动物门昆虫纲蜚蠊目昆虫，其他常见的种类还包括澳洲大蠊、日本姬蠊、德国小蠊、斑蠊等。美洲大蠊含有多糖、肽类和生物碱等活性成分，现代药理研究发现，其具有抗氧化、抗肝纤维化、保肝和抗肿瘤等作用〔2-3〕。美洲大蠊多糖具有较强的羟基自由基清除能力，在1 mg∕mL 的质量浓度下能增加损伤细胞的存活率，对过氧化氢（H2O2）损伤细胞具有保护作用〔4〕。张涛等〔5〕对美洲大蠊虫体95%乙醇提取物的化学成分进行了研究，从其乙酸乙酯部位分离得到14 个化合物，对已分离的14 个化合物进行体外抗氧化活性评价，结果显示化合物原儿茶酸、3，4-二羟基苯乙醇、1，2-二去氢-N-乙酰多巴胺具有显著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基的能力。李娴等〔6〕研究发现美洲大蠊油脂对H2O2所致人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞氧化损伤具有明显的保护作用。美洲大蠊醇提物能够增加大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量，降低一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）的含量，说明美洲大蠊醇提物对大鼠机体具有一定的抗氧化应激功能〔7〕。目前，已有关于美洲大蠊醇提物、多糖和油脂的抗氧化研究，未见美洲大蠊不同极性溶剂提取物抗氧化活性的报道。本研究采用体外抗氧化活性评价方法，对美洲大蠊水提取物（PAW）、乙醇提取物（PAEE）、正丁醇提取物（PABA）、乙酸乙酯提取物（PAEA）和石油醚提取物（PAPE）的抗氧化活性进行比较研究。

抗氧化剂是指能够延缓和阻止氧化反应，具有自由基清除能力和还原性的一类物质〔8〕。随着对合成抗氧化剂安全性疑虑的增加，人们更倾向于选用较为安全高效的天然抗氧化剂。近年来研究表明，任何一种单一的评价方法均无法充分地评价样品的抗氧化活性〔9〕，因此，需要使用不同方法从不同角度对物质的抗氧化活性进行研究。本研究利用6 种方法即清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS 自由基、DPPH 自由基能力，总还原能力和亚铁离子（Fe2+）的螯合能力来评价美洲大蠊提取物的抗氧化活性，为美洲大蠊资源的后续开发利用提供基础。

1 材料与仪器

1.1 美洲大蠊不同溶剂提取物的制备美洲大蠊干燥虫粉碎，过2 号筛。按照极性大小，依次用水、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚，料液比（g∕mL）为1：5，60 ℃回流提取3 次，每次为2.5 h，抽滤，合并滤液，于60 ℃下减压浓缩，冷冻干燥。

1.2 试剂DPPH（东京化成工业株式会社，批号：217-591-8）；抗坏血酸（Vc，上海化学试剂分装厂，批号：840110）；ABTS（索莱宝生物科技有限公司，批号：1109I032）；菲洛嗪（索莱宝生物科技有限公司，批号：1204L031）；邻苯三酚（瓯海化工试剂厂，批号：930608）；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器TU-1901 双光束紫外分光光度计（北京普析通用仪器责任有限公司）；雷磁PHS-3C 型pH计（上海精密科学仪器有限公司）；SK3200LH 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；AL240-IC分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；HYQ-3110涡旋混匀器（美国精骐有限公司）；HWS12恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 DPPH 自由基清除能力的测定清除DPPH 自由基活性实验参照文献〔10〕，略有改动。用蒸馏水将美洲大蠊不同溶剂提取物配制成不同浓度梯度（0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg∕mL）的溶液。取2 mL的1 mmol∕L DPPH（无水乙醇配置）溶液，加2 mL样品溶液，混合均匀，常温避光放置30 min，于517 nm处进行测定，以Vc作为阳性对照。清除率用以下公式计算：

式中，A1：待测样+DPPH 溶液的吸光度；A2：待测样+无水乙醇的吸光度；A0：蒸馏水+DPPH 溶液的吸光度。

2.2 ABTS自由基清除能力的测定测定方法参考文献〔11〕，并略作改动。将等体积2.6 mmol∕L 的过硫酸钾溶液和7.4 mmol∕L 的ABTS 溶液混合，避光，静置12 h，制成ABTS 储备液，用蒸馏水稀释，使其在734 nm 处的吸光度在0.9 左右，制成ABTS 工作液。将美洲大蠊不同溶剂提取物用蒸馏水配制成0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg∕mL的溶液。取待测样1 mL，加入ABTS 工作液6 mL，混合均匀，室温下反应10 min，在734 nm 处测定吸光度，以Vc 为阳性对照。样品对ABTS自由基清除率用以下公式计算：

式中，A1：1 mL 待测样+6 mL ABTS 工作液的吸光度；A2：1 mL待测样+6 mL蒸馏水的吸光度；A0：1 mL蒸馏水+6 mL ABTS工作液的吸光度。

2.3 羟基自由基清除能力的测定测定方法参考文献〔12〕，并略作改动。将美洲大蠊不同溶剂提取物配制成0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg∕mL 的溶液，分别取1 mL 溶液于比色管中，各管均加入5 mmol∕L水杨酸（无水乙醇配制）溶液1 mL、5 mmol∕L的硫酸亚铁（FeSO4）溶液1 mL，摇匀后加入0.07% H2O2溶液1 mL，振荡混匀，37 ℃水浴30 min，以Vc 作阳性对照，于510 nm处测定吸光度。样品对羟基自由基清除率用以下公式计算：

式中，A1：1 mL待测样+1 mL水杨酸溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL H2O2的吸光度；A2；1 mL 待测样+1 mL水杨酸溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL蒸馏水的吸光度；A0：1 mL蒸馏水+1 mL水杨酸溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL H2O2的吸光度。

2.4 超氧阴离子自由基清除能力的测定测定方法参考文献〔13〕，并略作改动。将美洲大蠊不同溶剂提取物配制成0.20、1.00、1.80、2.60、3.40 mg∕mL 的溶液，分别取1 mL 置于10 mL 试管中，再加入4 mL 0.1 mol∕L（pH=8.2）Tris-HCl 缓冲液混匀，用去离子水补充至9 mL，25 ℃水浴10 min，取出，立即加入1 mL 用10 mmol∕L HCl 溶液配制的3 mmol∕L 邻苯三酚溶液（25 ℃预热），快速摇匀后于320 nm处测定吸光度，间隔30 s测定一次，共计8次。以时间为横坐标，320 nm 处的吸光度为纵坐标，利用Elisa 软件进行线性回归得其斜率，斜率即为Vt。样品对超氧阴离子自由基清除率用以下公式计算：

式中，V0：邻苯三酚的自氧化速率；V1：加样后邻苯三酚的自氧化速率。

2.5 还原能力的测定测定方法参考文献〔14〕，并略作改动。将美洲大蠊不同溶剂提取物配制成不同浓度梯度0.20、0.50、0.80、1.10、1.40、1.70 mg∕mL 的溶液，分别取2 mL 于10 mL 离心管中，分别加入0.025 mol∕L（pH=6.8）的磷酸盐缓冲液2 mL、1%铁氰化钾2 mL，混匀后于50 ℃水浴反应20 min。冷却后加入10%三氯乙酸2 mL终止反应，3 000 r∕min离心10 min。取上清液2 mL，加入0.1%三氯化铁溶液0.5 mL 和蒸馏水2 mL，静置15 min，在700 nm 处测定吸光度，Vc作为阳性对照。吸光度与样品的还原能力有关，吸光度越大则还原能力越大。用以下公式计算还原能力：

式中，A1：反应后样品吸光度；A2：样品的本底吸光度。

2.6 对Fe2+螯合能力的测定测定方法参考文献〔15〕，并略作改动。将美洲大蠊不同溶剂提取物配制成不同浓度梯度（0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg∕mL）的溶 液，分 别 取2.5 mL 溶液，依次加入2 mmol∕L 的FeSO4溶液0.1 mL、2 mmol∕L 的菲洛嗪溶液0.2 mL，避光静置10 min，于562 nm 处测吸光度，乙二胺四乙酸（EDTA）为阳性对照。对Fe2+的螯合率计算公式如下：

式中，A1：2.5 mL 待测液+0.1 mL FeSO4溶液+0.2 mL菲洛嗪溶液的吸光度；A2：2.5 mL 待测液+0.1 mL 蒸馏水+0.2 mL 菲洛嗪溶液的吸光度；A0：2.5 mL 蒸馏水+0.1 mL FeSO4溶液+0.2 mL菲洛嗪溶液的吸光度。

3 结果

3.1 对DPPH 自由基的清除能力美洲大蠊不同溶剂提取物均具有DPPH自由基清除活性，清除能力随着样品浓度的升高而有不同程度的升高。相同浓度下，PABA 和PAEA 对DPPH 自由基的清除能力明显高于其他3种提取物。在高浓度下，两者之间清除能力相当，半抑制浓度（IC50）分别为0.16 mg∕mL 和0.18 mg∕mL，当浓度达到0.40 mg∕mL 时，清除能力趋于平缓，清除率超过80%，清除能力稍低于Vc。其余3 种提取物对DPPH 自由基的清除能力相对较弱，随着浓度的增大，其清除率上升缓慢。美洲大蠊不同溶剂提取物对DPPH 自由基清除能力大小依次为PABA＞PAEA＞PAEE＞PAW＞PAPE。见图1。

图1 美洲大蠊提取物对DPPH自由基的清除活性

3.2 对ABTS 自由基的清除能力美洲大蠊不同溶剂提取物浓度与ABTS自由基的清除率存在明显的量效关系，清除率随浓度升高而有不同程度的升高。当浓度为0.50 mg∕mL，PABA和PAEA的清除率分别为78%和74%，其IC50分别为0.18 mg∕mL和0.25 mg∕mL，清除ABTS 自由基活性明显低于Vc；PAPE 对ABTS自由基的清除能力最弱，当样品浓度为0.50 mg∕mL时，其清除率仅为0.49%。美洲大蠊不同溶剂提取物对ABTS 自由基的清除能力大小依次为PABA＞PAEA＞PAEE＞PAW＞PAPE。见图2。

图2 美洲大蠊提取物对ABTS自由基的清除活性

3.3 对羟基自由基的清除能力5种美洲大蠊提取物对羟基自由基的清除能力均随浓度增加而升高，其中，清除羟基自由基效果最佳的是PAW，IC50为1.25 mg∕mL，当浓度达到3.00 mg∕mL 时，清除率达87%，清除能力略低于Vc，且其清除率随浓度增加呈持续上升的趋势。此外，PAEE 也具有较好的清除羟基自由基能力，IC50为1.41 mg∕mL，当浓度达到3.00 mg∕mL时，清除率达82%。PAPE 对羟基自由基清除能力略低于PAEE，IC50为1.74 mg∕mL，在0.00～2.00 mg∕mL 浓度范围内，随着浓度增加，清除率迅速升高，清除能力高于PAEA 和PABA，当浓度达到2.00 mg∕mL时，清除能力就趋于平缓，清除率超过50%。PAEA和PABA对羟基自由基的清除活性相对较低，IC50分 别 为8.06 mg∕mL 和8.49 mg∕mL，当浓度达到3.00 mg∕mL，清除率达到37%左右。美洲大蠊不同溶剂提取物对羟基自由基的清除能力大小依次为PAW＞PAEE＞PAPE＞PAEA＞PABA。见图3。

图3 美洲大蠊提取物对羟基自由基的清除活性

3.4 对超氧阴离子自由基的清除能力根据结果分析可得，PAEE 和PAW 对超氧阴离子自由基的清除能力明显高于其他3 种提取物，随着浓度增加而显著升高，当样品浓度达到3.40 mg∕mL 时，清除率分别达到46%和49%，但都远低于Vc 对超氧阴离子自由基的清除活性。PAEA 和PABA 随着浓度增加，清除率上升缓慢。PAPE 浓度与超氧阴离子自由基的清除率量效关系不明显，清除率保持在20%左右。美洲大蠊不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除能力大小依次为PAEE＞PAW＞PAEA＞PABA＞PAPE。见图4。

图4 美洲大蠊提取物对超氧阴离子自由基的清除活性

3.5 总还原能力的测定在0.00～1.70 mg∕mL 的范围内，美洲大蠊不同溶剂提取物的还原能力与浓度具有一定的量效关系，还原能力随浓度增加而升高。美洲大蠊不同提取物中总还原能力最强的是PABA，当浓度达到1.70 mg∕mL 时，其还原能力达到1.19。PAEA 次之，还原力达1.09。美洲大蠊不同溶剂提取物还原能力均低于Vc，但也具有一定的抗氧化活性。美洲大蠊不同溶剂提取物总还原 能 力 大 小 依 次 为PABA＞PAEA＞PAW＞PAEE＞PAPE。见图5。

图5 美洲大蠊提取物的总还原能力

3.6 对Fe2+螯合能力在反应体系的浓度范围内，美洲大蠊不同溶剂提取物对Fe2+离子的螯合率均低于EDTA，随着浓度的增加，不同提取物对Fe2+螯合率上升，呈明显的量效关系。在0.00～2.50 mg∕mL的浓度范围内，PABA 对Fe2+离子的螯合率始终高于其余4种提取物，IC50为1.56 mg∕mL，其在2.50 mg∕mL时对Fe2+螯合率达到73%。在0.00～0.50 mg∕mL的浓度范围内，PAEE 对Fe2+螯合率低于其他提取物，但在0.50～2.50 mg∕mL 的浓度范围内，PAEE 对Fe2+螯合率迅速上升，高于PAW、PAPE 和PAEA，IC50为2.36 mg∕mL。在0.00～2.00 mg∕mL 的浓 度范围内，PAPE 对Fe2+螯合率低于PAW 和PAEA，当浓度达到2.50 mg∕mL 时，对Fe2+离子的螯合率迅速升高，达到31%，甚至高于PAEA。美洲大蠊不同溶剂提取物对Fe2+螯合能力大小依次为PABA＞PAEE＞PAEA＞PAPE＞PAW。见图6。

图6 美洲大蠊提取物对Fe2+螯合能力

4 讨论

本研究结合6 种不同方法对美洲大蠊5 种不同极性溶剂提取物体外抗氧化活性进行评价。由于各种方法的原理和灵敏度不同，浓度影响方法的正确评价，所以每种方法的检测浓度均不同。5 种美洲大蠊提取物均具有一定的抗氧化活性，但存在明显差异，且各提取物的抗氧化能力大小随评价方法的不同存在一定差异。

体外抗氧化活性评价方法有多种类型，其实验原理亦存在一定差异，DPPH、ABTS 自由基清除法和总还原能力法属于基于电子转移（SET）的方法，羟基自由基与超氧阴离子自由基清除法属于活性氧自由基清除能力法，Fe2+螯合能力法属于螯合过渡金属防止产生自由基的方法〔16〕，抗氧化活性分析是一个需采用多种方法进行全面评价的系统体系。本研究采用的DPPH 和ABTS 自由基清除法对5 种美洲大蠊提取物抗氧化活性测定的结果完全一致，而总还原能力法测定的结果与前两种方法测定结果的吻合度最高，这可能与DPPH、ABTS 自由基清除法和总还原能力法均属于SET 方法有关。羟基自由基与超氧阴离子自由基清除法结果显示PAW和PAEE 的抗氧化活性优于其他3 种提取物，该结果提示羟基自由基与超氧阴离子自由基清除法可能具有相关性。王颖等〔17〕关于白苏叶乙醇提取物体外抗氧化活性的研究表明，这两种方法测定的结果具有较高的相关性。

美洲大蠊不同溶剂提取物采用相同方法进行抗氧化活性评价，抗氧化能力各有不同，可能是由于不同溶剂提取物中活性成分存在差异，活性成分之间存在相互作用，从而影响了提取物的抗氧化能力。相同提取物采用不同方法进行抗氧化活性评价，活性不相同，可能是不同方法的抗氧化机制不同。6 种评价方法均证实5 种美洲大蠊提取物在一定浓度范围内均表现出不同程度的抗氧化活性，且呈浓度依赖性。综上所述，美洲大蠊提取物有望成为天然抗氧化剂来源，但其物质基础和体内外抗氧化机制需进一步研究。