肝郁脾虚方对失眠大鼠血浆和下丘脑胆囊收缩素-8的影响

张瑜 王秀峰 曾雪爱 黄俊山

(福建省中医药科学院，福州，350003)

失眠是指尽管有合适的睡眠机会和睡眠环境，依然对睡眠时间和(或)质量感到不满足，并且影响日间社会功能的一种主观体验[1]。随着现代快节奏生活的发展，失眠已经成为常见的睡眠障碍疾病，发病率高达10%～48%。目前失眠的人群年轻化，大多伴随焦虑、紧张、疲倦等症状。前期研究发现肝郁脾虚型失眠占肝郁类失眠的32.7%，比重最大[2]。中医药治疗肝郁脾虚型失眠疗效确切，临床中多运用针灸[3]、自拟方[4]、经方[5]，同时配合心理疏导[6]以及认知行为疗法等，在缩短病程、改善症状等方面疗效显著。肝郁脾虚方是黄俊山主任主要针对现代快节奏，高压力下产生的肝郁、脾虚并存的失眠人群而自拟的经验方，并根据临床经验不断进行加减优化。主要从疏肝解郁、补脾益气方面着手进行治疗，全方以疏肝解郁为主、补益脾气为辅，从肝木乘脾土角度治疗“肝旺脾虚”型失眠，体现标本兼治、虚实兼顾的治则，临床疗效确切，但作用机制尚不明确，而胆囊收缩素-8对于睡眠和消化道症状均有一定的影响。本研究应用肝郁脾虚失眠大鼠模型，通过观察中枢脑肠肽胆囊收缩素-8的含量变化，进一步为肝郁脾虚方加减防治失眠的理论提供科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠40只，体质量(200±20)g，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司[生产许可证号：SCXK(沪)2017～0005，合格证编号：20170005004461]。饲养于恒温(22±1)℃，12 h:12 h固定照明节律(08:00开灯)的环境下，自由饮水，饲固体饲料。

1.2 主要试剂 对氯苯丙氨酸(PCPA)(批号：C6506-25G)购自Sigma公司，大鼠胆囊收缩素-8(CCk-8)ELISA试剂盒(批号：ML059172-C)购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 药品 肝郁脾虚方加减颗粒剂(购自福建中医药大学附属第二人民医院，主要由甘松、郁金、合欢皮、北柴胡、党参、黄芪、炒白术、姜半夏、茯神、五味子、甘草组成。大鼠用量为成人的6倍(按体质量计算)，最终配成含生药低剂量为9.15 g/kg、中剂量为18.3 g/kg、高剂量为36.6 g/kg的溶液)，每天每只予以相应药液2 mL灌胃。

PCPA的配制：将PCPA充分研磨，溶于弱碱性生理盐水中，配成混悬液。

1.4 动物分组及造模 将40只大鼠随机分成5组，正常对照组8只(不参与造模)、肝郁脾虚失眠模型组8只(参与造模，不予给药)、肝郁脾虚加减方高、中、低剂量组各8只(参与造模，并给药)，适应性喂养3 d后开始造模。

采用目前睡眠研究领域常用的大鼠慢性夹尾刺激+PCPA腹腔注射复合因子+不规则饮食法(逢单日禁食，饮水正常)制造肝郁脾虚失眠模型，先采用夹尾刺激法致肝郁，除正常对照组外，其余4组的大鼠每笼8只喂养，用尖端包裹纱布的大弯止血钳，夹住其中一只大鼠的尾巴，令其与笼中其他大鼠撕打，从而激怒全笼大鼠，令全笼大鼠处于对峙状态，每次刺激30 min，2次/d，连续刺激1周；除正常对照组外，其余4组大鼠逢单日禁食，双日给予称好质量的200 g食物，饮水正常；然后采用PCPA按300 mg/kg溶于弱碱性生理盐水中，配制成混悬液，以10 mL/kg腹腔注射，连续腹腔注射PCPA2d，大鼠昼夜节律消失，睡眠减少直至消失、便溏、饮食量减少、活跃程度减弱，情绪由开始的易怒烦躁变成情绪低落等表示造模成功。

1.5 动物给药 造模成功后第3天每天8:30开始灌胃，中药高、中、低剂量组分别按含生药为36.6 g/kg、18.3 g/kg、9.15 g/kg的溶液灌胃给药，正常对照组和模型组均给予蒸馏水灌胃，1次/d，共14 d。

1.6 取材

1.6.1 血浆 末次给药1 h后，戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉各组大鼠。麻醉后迅速下腹主动脉取血，用EDTA-2K真空抗凝管采血3 mL，30 min内2 500×g离心10 min，分离血浆，于-80 ℃保存待测。

1.6.2 下丘脑 取血后立即将5组大鼠断头处死，取出大脑，分离下丘脑，用电子秤下丘脑的重量，然后把下丘脑置于玻璃匀浆管内，加入对应体积的PBS(按1∶9的重量体积比)充分研磨，最后将匀浆液于2 500×g离心10 min，取上清液，-80 ℃保存待测。

1.7 酶联免疫吸附测定 CCK-8含量检测方法依据ELISA检测试剂盒操作说明进行。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态观察 正常对照组大鼠昼夜节律规律、状态良好、毛发有光泽、反应灵敏、情绪稳定、大便正常、体质量逐日增加；注射PCPA后，模型组和给药组大鼠昼夜节律消失、便溏、饮食量减少、活跃程度减弱、情绪由开始的易怒烦躁变成情绪低落。肝郁脾虚方加减颗粒剂用药后，大鼠精神状态、便溏、体质量等较模型组有明显改善。

表1 各组大鼠血浆和下丘脑CCK-8含量比较

2.2 各组大鼠血浆及下丘脑组织CCK-8含量比较 与正常组比较，模型组血浆和下丘脑CCK-8含量均下降，差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，给药中剂量和低剂量组血浆中CCK-8含量增加，差异有统计学意义(P<0.05)，高剂量组、中剂量和低剂量组下丘脑CCK-8含量较模型组均增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

失眠总病机为阳盛阴衰，阳不入阴，阳盛阴衰易失眠[5]。既往对不寐的病机研究集中在痰热扰心、肝火扰心、心肾不交、心脾两虚、心胆气虚等方面。近年来，社会竞争越来越激烈，工作、学习压力等越来越大，不能随心所欲，所欲不顺，情志不遂容易导致肝郁，生活节奏的加快，大多数人出现了饮食不规律、饥饱不均或劳累疲倦都容易损伤脾气。不寐随着现代生活的改变，出现了新的特点，其中情志和饮食成为了不寐产生的重要病因。历代医家对肝郁脾虚失眠早有阐述，《类证治裁》指出“思虑伤脾……经年不寐”。医圣张机从肝论治失眠非常注重“见肝之病……当先实脾”。肝主疏泄，情志不畅，肝失疏泄，经气郁滞，木克土，肝郁之气横逆犯脾致脾气虚弱，脾主运化，脾虚气血生化不足，影响肝藏血疏泄功能，脾气虚弱，不能运化水谷精微，则容易出现腹胀、便溏等症状。肝失疏泄，阴阳出入失调，脾失运化，心失所养，而致肝郁脾虚失眠。

脑肠肽是同时存在在大脑和胃肠道的胃肠激素或神经肽，在中枢神经系统可作为神经递质起作用，也可作为神经调质起作用，可改变神经末梢对递质的释放或改变靶细胞对神经递质的反应。CCK-8是典型的脑肠肽，也是迄今发现脑中含量最高的多肽，具有胆囊收缩素全部生物活性，在中枢神经系统主要分布在下丘脑、大脑皮质、海马、杏仁核以及外周血中[7]。脑-肠失衡是失眠发生的核心原因之一[8]，大鼠腹腔注射胆囊收缩素-八肽硫酸酯(CCK)[9]，结果显示能增加睡眠，增加脑电图慢波活动，对非快速眼动睡眠有明显的促进作用，减少运动活动，抑制进食，降低脑温度。Lanza等[10]报道CCK-8可以促进释放γ氨基丁酸(GABA)酸的产生，作为一种抑制性神经递质，通过CCKB受体对延长非快速眼动也发挥生理作用。加味酸枣仁汤[11]在大鼠胃肠不适相关失眠症模型中具有催眠和胃保护作用，可降低胃酸pH值，降低胃泌素、胃蛋白酶和食欲素-a的生成，增加了MTL和CCK-8的表达，血清GABA浓度升高，Glu/GABA比值降低，改善失眠主要表现为睡眠潜伏期缩短、睡眠时间延长和减少焦虑的行为。

本研究采用目前睡眠研究领域常用的大鼠慢性夹尾刺激+PCPA腹腔注射复合因子+不规则饮食法(逢单日禁食，饮水正常)制造肝郁脾虚失眠模型，其结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血浆和下丘脑中CCK-8的含量减少，肝郁脾虚方加减颗粒剂高、低、中组治疗后，中剂量和低剂量组血浆CCK-8含量增加，高剂量组、中剂量组、低剂量组下丘脑CCK-8含量明显高于模型组。以此显示，肝郁脾虚方加减对失眠大鼠的调节机制之一可能是通过调控CCK-8来实现，作为神经肽，CCK-8在中枢与γ-氨基丁酸及谷氨酸能神经元共存，在功能上互相调节，肝郁脾虚方加减可增加血浆和下丘脑中CCK-8含量，是否对GABA、5-HT以及腺苷有影响，仍需进一步探讨。