APP下载

肝郁脾虚方对失眠大鼠血浆和下丘脑胆囊收缩素-8的影响

2021-03-18张瑜王秀峰曾雪爱黄俊山

世界睡眠医学杂志 2021年1期
关键词:造模下丘脑肝郁

张瑜 王秀峰 曾雪爱 黄俊山

(福建省中医药科学院,福州,350003)

失眠是指尽管有合适的睡眠机会和睡眠环境,依然对睡眠时间和(或)质量感到不满足,并且影响日间社会功能的一种主观体验[1]。随着现代快节奏生活的发展,失眠已经成为常见的睡眠障碍疾病,发病率高达10%~48%。目前失眠的人群年轻化,大多伴随焦虑、紧张、疲倦等症状。前期研究发现肝郁脾虚型失眠占肝郁类失眠的32.7%,比重最大[2]。中医药治疗肝郁脾虚型失眠疗效确切,临床中多运用针灸[3]、自拟方[4]、经方[5],同时配合心理疏导[6]以及认知行为疗法等,在缩短病程、改善症状等方面疗效显著。肝郁脾虚方是黄俊山主任主要针对现代快节奏,高压力下产生的肝郁、脾虚并存的失眠人群而自拟的经验方,并根据临床经验不断进行加减优化。主要从疏肝解郁、补脾益气方面着手进行治疗,全方以疏肝解郁为主、补益脾气为辅,从肝木乘脾土角度治疗“肝旺脾虚”型失眠,体现标本兼治、虚实兼顾的治则,临床疗效确切,但作用机制尚不明确,而胆囊收缩素-8对于睡眠和消化道症状均有一定的影响。本研究应用肝郁脾虚失眠大鼠模型,通过观察中枢脑肠肽胆囊收缩素-8的含量变化,进一步为肝郁脾虚方加减防治失眠的理论提供科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠40只,体质量(200±20)g,购自上海斯莱克试验动物有限责任公司[生产许可证号:SCXK(沪)2017~0005,合格证编号:20170005004461]。饲养于恒温(22±1)℃,12 h:12 h固定照明节律(08:00开灯)的环境下,自由饮水,饲固体饲料。

1.2 主要试剂 对氯苯丙氨酸(PCPA)(批号:C6506-25G)购自Sigma公司,大鼠胆囊收缩素-8(CCk-8)ELISA试剂盒(批号:ML059172-C)购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 药品 肝郁脾虚方加减颗粒剂(购自福建中医药大学附属第二人民医院,主要由甘松、郁金、合欢皮、北柴胡、党参、黄芪、炒白术、姜半夏、茯神、五味子、甘草组成。大鼠用量为成人的6倍(按体质量计算),最终配成含生药低剂量为9.15 g/kg、中剂量为18.3 g/kg、高剂量为36.6 g/kg的溶液),每天每只予以相应药液2 mL灌胃。

PCPA的配制:将PCPA充分研磨,溶于弱碱性生理盐水中,配成混悬液。

1.4 动物分组及造模 将40只大鼠随机分成5组,正常对照组8只(不参与造模)、肝郁脾虚失眠模型组8只(参与造模,不予给药)、肝郁脾虚加减方高、中、低剂量组各8只(参与造模,并给药),适应性喂养3 d后开始造模。

采用目前睡眠研究领域常用的大鼠慢性夹尾刺激+PCPA腹腔注射复合因子+不规则饮食法(逢单日禁食,饮水正常)制造肝郁脾虚失眠模型,先采用夹尾刺激法致肝郁,除正常对照组外,其余4组的大鼠每笼8只喂养,用尖端包裹纱布的大弯止血钳,夹住其中一只大鼠的尾巴,令其与笼中其他大鼠撕打,从而激怒全笼大鼠,令全笼大鼠处于对峙状态,每次刺激30 min,2次/d,连续刺激1周;除正常对照组外,其余4组大鼠逢单日禁食,双日给予称好质量的200 g食物,饮水正常;然后采用PCPA按300 mg/kg溶于弱碱性生理盐水中,配制成混悬液,以10 mL/kg腹腔注射,连续腹腔注射PCPA2d,大鼠昼夜节律消失,睡眠减少直至消失、便溏、饮食量减少、活跃程度减弱,情绪由开始的易怒烦躁变成情绪低落等表示造模成功。

1.5 动物给药 造模成功后第3天每天8:30开始灌胃,中药高、中、低剂量组分别按含生药为36.6 g/kg、18.3 g/kg、9.15 g/kg的溶液灌胃给药,正常对照组和模型组均给予蒸馏水灌胃,1次/d,共14 d。

1.6 取材

1.6.1 血浆 末次给药1 h后,戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉各组大鼠。麻醉后迅速下腹主动脉取血,用EDTA-2K真空抗凝管采血3 mL,30 min内2 500×g离心10 min,分离血浆,于-80 ℃保存待测。

1.6.2 下丘脑 取血后立即将5组大鼠断头处死,取出大脑,分离下丘脑,用电子秤下丘脑的重量,然后把下丘脑置于玻璃匀浆管内,加入对应体积的PBS(按1∶9的重量体积比)充分研磨,最后将匀浆液于2 500×g离心10 min,取上清液,-80 ℃保存待测。

1.7 酶联免疫吸附测定 CCK-8含量检测方法依据ELISA检测试剂盒操作说明进行。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态观察 正常对照组大鼠昼夜节律规律、状态良好、毛发有光泽、反应灵敏、情绪稳定、大便正常、体质量逐日增加;注射PCPA后,模型组和给药组大鼠昼夜节律消失、便溏、饮食量减少、活跃程度减弱、情绪由开始的易怒烦躁变成情绪低落。肝郁脾虚方加减颗粒剂用药后,大鼠精神状态、便溏、体质量等较模型组有明显改善。

表1 各组大鼠血浆和下丘脑CCK-8含量比较

2.2 各组大鼠血浆及下丘脑组织CCK-8含量比较 与正常组比较,模型组血浆和下丘脑CCK-8含量均下降,差异有统计学意义(P<0.05),与模型组比较,给药中剂量和低剂量组血浆中CCK-8含量增加,差异有统计学意义(P<0.05),高剂量组、中剂量和低剂量组下丘脑CCK-8含量较模型组均增加,差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

失眠总病机为阳盛阴衰,阳不入阴,阳盛阴衰易失眠[5]。既往对不寐的病机研究集中在痰热扰心、肝火扰心、心肾不交、心脾两虚、心胆气虚等方面。近年来,社会竞争越来越激烈,工作、学习压力等越来越大,不能随心所欲,所欲不顺,情志不遂容易导致肝郁,生活节奏的加快,大多数人出现了饮食不规律、饥饱不均或劳累疲倦都容易损伤脾气。不寐随着现代生活的改变,出现了新的特点,其中情志和饮食成为了不寐产生的重要病因。历代医家对肝郁脾虚失眠早有阐述,《类证治裁》指出“思虑伤脾……经年不寐”。医圣张机从肝论治失眠非常注重“见肝之病……当先实脾”。肝主疏泄,情志不畅,肝失疏泄,经气郁滞,木克土,肝郁之气横逆犯脾致脾气虚弱,脾主运化,脾虚气血生化不足,影响肝藏血疏泄功能,脾气虚弱,不能运化水谷精微,则容易出现腹胀、便溏等症状。肝失疏泄,阴阳出入失调,脾失运化,心失所养,而致肝郁脾虚失眠。

脑肠肽是同时存在在大脑和胃肠道的胃肠激素或神经肽,在中枢神经系统可作为神经递质起作用,也可作为神经调质起作用,可改变神经末梢对递质的释放或改变靶细胞对神经递质的反应。CCK-8是典型的脑肠肽,也是迄今发现脑中含量最高的多肽,具有胆囊收缩素全部生物活性,在中枢神经系统主要分布在下丘脑、大脑皮质、海马、杏仁核以及外周血中[7]。脑-肠失衡是失眠发生的核心原因之一[8],大鼠腹腔注射胆囊收缩素-八肽硫酸酯(CCK)[9],结果显示能增加睡眠,增加脑电图慢波活动,对非快速眼动睡眠有明显的促进作用,减少运动活动,抑制进食,降低脑温度。Lanza等[10]报道CCK-8可以促进释放γ氨基丁酸(GABA)酸的产生,作为一种抑制性神经递质,通过CCKB受体对延长非快速眼动也发挥生理作用。加味酸枣仁汤[11]在大鼠胃肠不适相关失眠症模型中具有催眠和胃保护作用,可降低胃酸pH值,降低胃泌素、胃蛋白酶和食欲素-a的生成,增加了MTL和CCK-8的表达,血清GABA浓度升高,Glu/GABA比值降低,改善失眠主要表现为睡眠潜伏期缩短、睡眠时间延长和减少焦虑的行为。

本研究采用目前睡眠研究领域常用的大鼠慢性夹尾刺激+PCPA腹腔注射复合因子+不规则饮食法(逢单日禁食,饮水正常)制造肝郁脾虚失眠模型,其结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血浆和下丘脑中CCK-8的含量减少,肝郁脾虚方加减颗粒剂高、低、中组治疗后,中剂量和低剂量组血浆CCK-8含量增加,高剂量组、中剂量组、低剂量组下丘脑CCK-8含量明显高于模型组。以此显示,肝郁脾虚方加减对失眠大鼠的调节机制之一可能是通过调控CCK-8来实现,作为神经肽,CCK-8在中枢与γ-氨基丁酸及谷氨酸能神经元共存,在功能上互相调节,肝郁脾虚方加减可增加血浆和下丘脑中CCK-8含量,是否对GABA、5-HT以及腺苷有影响,仍需进一步探讨。

猜你喜欢

造模下丘脑肝郁
柴芍六君汤加味结合自血疗法对脾虚肝郁型慢性荨麻疹患者的疗效观察
蛋鸡输卵管炎造模方法的筛选与验证
SD大鼠哮喘模型建立方法及评价的比较研究
一过性食管下括约肌松弛动物模型的建立及其机制探讨
改变肝郁体质,要想得开
大鼠失眠模型造模中对氯苯丙氨酸混悬液改良法的探讨
自拟方结肠灵汤治疗肝郁气滞型功能性消化不良临床观察
科学家发现控制衰老开关
谢旭善教授从肝气肝郁证论治胃脘痛经验
正念认知疗法在抑郁症患者日常护理中的应用