LncRNA HOTAIR通过调控miR-30d影响鼻咽癌细胞的侵袭和迁移

陈曦 朱悦莹 施典羽 颜帅 汤国栋 邹宇

1广东省妇幼保健院耳鼻咽喉科（广州511400）；2深圳市龙华区人民医院耳鼻咽喉科（广东深圳518109）

鼻咽癌是我国南方地区尤其是广东省高发的肿瘤之一，占头颈部肿瘤发病率首位。鼻咽癌的重要临床特点是易发生局部和远处转移，颈部淋巴结转移率高达70%以上［1-2］，有约30% ～40%的鼻咽癌患者由于转移和复发未能长期生存。HOTAIR是被发现的第一个有反式调节转录作用并影响其他染色体基因转录的LncRNA［3］，HOTAIR的高表达与包括结肠癌在内的多个恶性肿瘤的复发转移及不良预后密切相关［4-6］。最新研究表明HOTAIR 在鼻咽癌中表达水平升高，与鼻咽癌的T 分期和N 分期密切相关，提示HOTAIR 的高表达可能与鼻咽癌的增殖转移关系密切［7］，然而目前有关HOTAIR 在鼻咽癌发生发展中的研究较少，相关机制尚未明确。前期通过软件分析发现HOTAIR 在miR-30 家族中有多个调控位点。研究显示miR-30 家族成员在鼻咽癌组织中较癌旁正常组织表达下降［8-9］，根据生物信息学分析，本研究选择miR-30d 作为HOTAIR 的调控目标，研究两者的作用可能对鼻咽癌细胞侵袭迁移及相关调节蛋白带来的影响，以期进一步阐明该疾病的转移机制，有望建立更有效的靶向治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料鼻咽癌CNE-2 细胞购自广州索友百生物科技有限公司，HOTAIR siRNA、miR-30d mimics和miR-30d inhibitor 及相应对照组由上海吉玛生物制药有限公司合成，cDNA 合成及定量PCR 试剂盒购自Takara 公司，Anti-Vimentin（3932S）和Anti-E-cadherin（14472S）抗体购自Cell signal technology公司，Anti-GRP78（H-129）抗体购自Santa cruz 公司，荧光素酶检测试剂盒（E1910）购自Promega 公司，荧光素酶报告载体由上海欣基生物科技有限公司构建，Lipofectamine3000 转染试剂购自Invitrogen，引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。HOTAIR 上游5′-CCACAUGAACGCCCAGAGAUUTT-3′，下游5′-GAACGGGAGUACAGAGAGAUU-3′；miR-30d 上游5′-GGGTGTAAACATCCCCGACT-3′，下游5′-CGTATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；GAPDH 上游5′-TGGCACCCAGCACAATGA A-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCG CCTAGAAGCA-3′；U6 上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCRTrizol 法抽提细胞总RNA，纯度检测合格后反转录成cDNA，采用SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒进行定量PCR 检测，PCR 反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃34 s，40 个循 环；HOTAIR 和miR-30d 分 别 以GAPDH 和U6 作为内参。

1.2.2 Transwell 法检测CNE-2 细胞侵袭和迁移数目用不含血清的细胞培养液将各研究组细胞配制成浓度为1 × 106/mL 的单细胞悬浮液，将100 μL 的细胞悬浮液添加到Transwell 小室的上室中，在下室中添加含有10%胎牛血清的细胞培养液，37 ℃孵育24 h，用棉签将没有穿膜的细胞擦掉，结晶紫染色后在显微镜下随机选取5 个视野分析细胞迁移数目；侵袭实验步骤同上，在侵袭实验前用基质胶将小室湿化。

1.2.3 Western blot 检测蛋白表达提取转染48 h后的各组细胞总蛋白并进行定量，按每1 μL 样品加入0.25 μL 上样缓冲液的比例混合，沸水加热变性5 min，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后迁移至硝酸纤维素膜，加入5 g脱脂奶粉与100 mL TBST配成的封闭缓冲液，置于振荡培养箱中26 ℃封闭2 h，洗膜后分别加入E-cadherin，vimentin（1∶500）及GRP78 一抗（1∶250），4 ℃孵育过夜；再分别用辣根过氧化酶标IgG 抗体（1∶1 500）二抗杂交，GAPDH 作为内参，比较目的条带灰度值，实验重复3 次。

1.2.4 双荧光素酶报告基因检测将HOTAIR 结合序列突变，分别构建突变型（pmiRGLO-HOTAIRMUT）和野生型荧光素酶报告载体（pmiRGLO-HOTAIR-WT）。将HOTAIR-MUT 和HOTAIR-WT 与miR-30dmimics 和mimics control 共转染至CNE-2 细胞中，培养48 h 后检测荧光素酶活性。

1.2.5 细胞转染与分组按转染试剂说明书要求将HOTAIR siRNA 和siRNA control 转染至CNE-2 细胞中，把转染HOTAIR siRNA 和siRNA control 后的细胞设置为si-HOTAIR 组和si-con 组，未转染的细胞设为control 组。RT-qPCR 检测转染效率；设置转染miR-30d mimics 和mimics control 后 的CNE-2 细胞为miR-30d 组和miR-NC 组，RT-qPCR 检测两组细胞miR-30d 的表达；同时用RT-qPCR 检测control、si-con、si-HOTAIR、vector（转染阴性对照载体pcDNA3.1）和HOTAIR（转染pcDNA3.1-HOTAIR）各组细胞中miR-30d 的表达，U6 作为内参。在CNE-2 细胞中共转染HOTAIR siRNA 和miR-30d inhibitor，命名为si-HOTAIR+anti-miR-30d 组；共转染HOTAIR siRNA 和inhibitor control，命名为si-HOTAIR+anti-NC 组，用RT-qPCR、Western blot 以及Transwell 法检测CNE-2 细胞中相关基因蛋白的表达及侵袭和迁移细胞数目。

1.3 统计学方法应用SPSS 16.0 进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，两组数据间比较用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用SNK 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调HOTAIR 抑制CNE-2 细胞侵袭、迁移数目及GRP78 和EMT 相关蛋白表达RT-qPCR 检测HOTAIR 转染效率，CNE-2 细胞中si-HOTAIR 组HOTAIR基因表达水平明显低于si-con组（P＜0.05），见图1A。与si-con 组相比，si-HOTAIR 组CNE-2 细胞的侵袭和迁移数目明显降低，同时细胞中上皮细胞分子标志物E-cadherin 水平升高，间质细胞分子标志物vimentin 水平降低，GRP78 表达下降（P＜0.05），见图1B、C。

图1 下调HOTAIR 后CNE-2 细胞侵袭、迁移数目及相关蛋白表达变化Fig.1 The change of the invasion and migration number of CNE-2 cells and the expression of related proteins after down-regulation of HOTAIR

2.2 HOTAIR 靶向负调控miR-30d 的表达根据RNA22 version 2.0 预测 的HOTAIR 和miR-30d 靶 向结合位点（图2A），转染miR-30d mimics 后，细胞中的miR-30d 表达升高（图2B），HOTAIR-WT 和miR-30d mimics 共转染后细胞荧光素酶活性降低（图2C），在CNE-2 细胞中si-HOTAIR 组miR-30d 的表达水平明显高于si-con 组；HOTAIR 组miR-30d 的表达水平明显低于vector 组（图2D）；结果显示HOTAIR 可以负向调控miR-30d 的表达。

图2 HOTAIR 靶向负调控miR-30d 的表达Fig.2 HOTAIR negatively regulates the expression of miR-30d specifically

2.3 下调miR-30d逆转敲减HOTAIR对CNE-2细胞侵袭、迁移数目及EMT相关蛋白的影响CNE-2细胞中si-HOTAIR＋anti-miR-30d 组miR-30d 的表达水平明显低于si-HOTAIR+anti-NC 组（P＜0.05），说明转染miR-30d inhibitor 后明显抑制miR-30d的表达（图3A）。与si-HOTAIR+anti-NC 组相比，si-HOTAIR+anti-miR-30d 组在CNE-2 细胞中的侵袭和迁移数目增加（图3B），免疫印迹结果显示vimentin 和GRP78 表达增加，E-cadherin 表达下降（图3C）。

3 讨论

鼻咽癌的侵袭转移涉及多个基因和信号通路的改变，HOTAIR 在许多肿瘤的发生进展中起重要作用，介导了包括肺癌、胃癌等多种癌症的发生和转移［10-11］。本实验发现下调HOTAIR 表达后，鼻咽癌细胞的侵袭、迁移能力降低，这与其它肿瘤的研究结果一致，提示HOTAIR 可能是肿瘤侵袭促进因子。有研究显示其表达与鼻咽癌放疗效果不佳呈正相关，可作为评估肿瘤进展和患者生存率的独立预后指标［12］。一些异常表达的LncRNA与相关miRNA 的相互作用被证实是鼻咽癌发生和转移的重要分子生物学基础［13-14］，miR-30d 是miR-30家族的六个成员之一，在多个类型的人类上皮肿瘤研究发现miR-30d 表达的调节异常［15-16］，证实miR-30d 通过调控GNA13 在抑制结直肠癌的增殖和侵袭中发挥了重要的作用［17］。事实上大部分LncRNA 都可以作为竞争性内源RNA 发挥海绵效应抑制miRNA，并进一步调节下游蛋白表达［18］。

肿瘤细胞迁移的关键步骤是细胞的迁移运动，部分上皮细胞向间质细胞转化（EMT），细胞间紧密连接被破坏，黏附减弱，运动増强，使细胞获得了游走的能力。GRP78 是一类调节肿瘤细胞凋亡与血管生成的蛋白，在鼻咽癌细胞中沉默GRP78，可以促进细胞凋亡，使细胞对去离子辐射和顺铂的抵抗力下降［19］。FU 等［20］在鼻咽癌细胞和标本中发现HOTAIR 可以通过靶向GRP78 介导的VEGFA 和Ang2 表达上调来促进肿瘤血管的生成，这可能是促进鼻咽癌侵袭转移的机制之一。综上所述，本研究表明HOTAIR 可以通过miR-30d 调节GRP78 和EMT 相关蛋白的表达，并有利于促进鼻咽癌细胞的侵袭与迁移。下一步将深入研究miR-30d 与GRP78 和EMT 相关蛋白之间的关系进一步阐明其具体调控机制。

图3 miR-30d inhibitor 逆转敲减HOTAIR 对CNE-2 细胞侵袭、迁移及相关蛋白表达的影响Fig.3 The miR-30d inhibitorreversedtheeffectsof HOTAIR knock-down oninvasion，migration abilities of CNE-2 cells and the expression of related protein