越冬期间水体氨氮对红螯螯虾生理功能的影响研究

程 顺，韦永春，李 飞，迟美丽，贾永义，刘士力，郑建波，顾志敏

(浙江省淡水水产研究所，农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江 湖州 313001)

红螯螯虾又名澳洲淡水龙虾，比普通虾生长速度快、规格大、出肉率高，且胆固醇含量仅为普通虾的70%，是一个具有较高增养殖潜力且深受消费者青睐的品种。在21 世纪初，浙江省淡水水产研究所从澳大利亚引进红螯螯虾，并进行了亲虾培育、人工越冬等一系列研究，为室内规模化苗种繁育的开展打下了基础。但目前虾苗批量化供应能力的不足及虾苗价格过高等瓶颈阻碍着红螯螯虾市场的扩大，造成这一现状的原因之一是红螯螯虾亲虾在室内越冬过程中进行室内小水体培育，环境的变化极易影响水质指标，进而造成亲虾体质的下降及生长与繁殖的受限。

在红螯螯虾亲虾室内越冬过程中，水体中的氨氮主要由残饵、虾体排泄物等含氮有机物分解产生，是主要的胁迫因子之一。目前大部分的研究关注氨氮急性胁迫下虾的成活率，可是在实际生产中一般氨氮不会达到致死的浓度，而低于致死浓度的氨氮也会对虾的生长与存活产生影响，这是由于机体在受到氨氮连续刺激且超过机体调节阈值时，其抗氧化系统遭到破坏、组织结构发生病变所致。因此，必须在探讨氨氮致死浓度的同时，分析氨氮对组织器官的损伤及对抗氧化指标、免疫相关指标、能量代谢指标的影响，以便更好地指导实际生产中的水质管理，改善亲本在越冬期间的生长状况。

一般红螯螯虾亲虾从外塘移入温室初期，氨氮会达到0.4 毫克/升左右，需要经过一段时间才能稳定在0.2 毫克/升以下。因此，本试验在确定氨氮胁迫下螯虾96 小时半致死浓度和安全浓度后，分别设置空白对照、低浓度、中浓度和高浓度氨氮试验组，同时结合组织切片、酶活性检测方法分析肝胰腺结构以及相关抗氧化指标、免疫相关指标、能量代谢指标变化，从组织和生理生化水平探讨氨氮胁迫对红螯螯虾的影响，旨在为红螯螯虾亲虾越冬及生态养殖过程中的水质管理提供科学依据。

一、材料与方法

1.试验材料

试验用虾均采自浙江省淡水水产研究所综合试验基地，选取越冬期间体色正常、健康活泼、规格相近的红螯螯虾亲虾。

2.试验方法

采用常规生物急性毒性试验法，研究0～200毫克/升氨氮浓度对红螯螯虾亲虾的急性毒性，得到24～96 小时的死亡率，并通过概率单位法计算半致死浓度以及安全浓度。然后结合红螯螯虾亲虾越冬的生产实际，分别设置对照组(0 毫克/升)和低浓度(0.4 毫克/升)、中浓度(1.0 毫克/升)、高浓度(2.0 毫克/升)3 个试验组，每组设置3个平行。用分析纯氯化铵试剂配制试验组总氨氮浓度。挑选红螯螯虾亲虾随机移入水槽中。试验期间停止投饵，并每隔12 小时进行换水及总氨氮浓度监测，使总氨氮浓度稳定，水温为(22±1)℃，24小时连续微充气以保证溶氧充足。

氨氮胁迫96 小时后采集样品。每次从各组水槽中随机取螯虾的肝胰腺并保存于波恩氏液及液氮中。波恩氏液保存的样品常规石蜡包埋，连续横切，切片厚度为6微米，HE染色，显微镜观察并拍照。液氮保存的样品之后转移至-80℃超低温冰箱保存。按每克待测样组织加入9毫升生理盐水的比例配制组织匀浆，研磨后转移至离心管中，4℃下以3 000 转/分离心10 分钟，取上清液分装后放入4℃冰箱暂存，用于测定抗氧化指标如超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、免疫相关指标如酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性，测定能量代谢指标如甘油三酯(TG)水平。酶活指标均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

3.数据处理

试验数据分析采用Excel、SPSS进行处理，统计结果以平均值与标准差(X±SD)表示。

二、结果

1.氨氮胁迫急性毒性试验

采用常规生物急性毒性试验法研究氨氮对红螯螯虾96 小时的半致死浓度以及安全浓度，结果显示红螯螯虾的死亡率随氨氮浓度及胁迫时间的增加而增加。同时，通过SPSS 的概率单位法计算得到氨氮对红螯螯虾96 小时的半致死浓度为56.84毫克/升，安全浓度(SC)为5.68毫克/升。

此外，笔者发现在氨氮高于50毫克/升的条件下，死亡前的红螯螯虾首先是活力减弱，有时身体向后上方急退，然后失去平衡，四肢无力，最后侧卧于水底，随即死亡。

2.氨氮胁迫对肝胰腺组织学的影响

组织切片观察发现，对照组上皮细胞无断裂，排列整齐，分支管状腺之间的结缔组织较多而互相联系；低浓度组(0.4 毫克/升)与对照组形态一致，也未出现形态学的改变；中浓度组(1.0 毫克/升)的肝小管排列开始混乱，各肝小管大小出现差异，肝小管间距离变大，但总体上变化不明显；高浓度组(2.0 毫克/升)肝小管的整体结构出现变化，即肝小管排列混乱，各肝小管大小出现差异，基膜变得不整齐，肝小管间的结缔组织减少，细胞出现裂解，产生空泡化。总体上，在96 小时内，随着氨氮质量浓度的增加，红螯螯虾肝胰腺内的肝小管排列趋于混乱，大小出现差异，肝小管间的结缔组织也随之减少，细胞出现裂解，产生空泡化，在高浓度组(2.0 毫克/升)中的变化相对明显。因此，中浓度氨氮(1.0毫克/升)对虾的肝胰腺造成了轻微损伤，高浓度氨氮(2.0毫克/升)对虾的肝胰腺造成了较大的损伤。

3.氨氮胁迫对肝胰腺内酶活力的影响

酶活检测结果表明，在氨氮为0～2.0毫克/升范围内，抗氧化指标SOD 活性为33.77～38.08 单位/毫克，且随氨氮质量浓度的升高而降低，其中氨氮为1.0～2.0 毫克/升组的SOD 值显著低于氨氮为0 毫克/升的对照组(P＜0.05)；而MDA 则相反，为1.73～2.20单位/毫克，且随氨氮质量浓度的升高而升高，其中高浓度氨氮组(2.0毫克/升)的MDA值显著高于其他3 组(P＜0.05)(表1)。在氨氮为0～2.0 毫克/升范围内，免疫相关指标ACP 值为84.89～119.16 单 位/毫 克 、 AKP 值 为 25.87～80.17 单位/毫克，且均随氨氮质量浓度的升高而降低，4个氨氮组的ACP、AKP值均呈显著差异(P＜0.05)，高浓度氨氮组(2.0 毫克/升)的值最低(表2)。在氨氮为0～2毫克/升范围内，能量代谢指标TG值为0.16～0.23毫摩/克，且随氨氮质量浓度的升高而降低，但4 个氨氮组的TG 值无显著差异(P＞0.05)(表3)。除MDA 外，总体上抗氧化能力、免疫相关指标及能量代谢相关指标均随氨氮质量浓度的升高而降低，高浓度氨氮组(2.0 毫克/升)的抗氧化能力、免疫相关指标及能量代谢相关指标最低。中浓度氨氮组(1.0 毫克/升)及高浓度氨氮组(2.0 毫克/升)的 SOD 值、ACP 值、AKP 值显著低于对照组(0毫克/升)(P＜0.05)，高浓度氨氮组(2.0 毫克/升)的 MDA 值、ACP 值、AKP 值显著低于其他3组(P＜0.05)。

表1 抗氧化指标检测情况

表2 免疫相关指标检测情况

表3 能量代谢指标检测

三、分析与讨论

红螯螯虾对氨氮有较强的耐受力，其96 小时半致死浓度为56.84 毫克/升，安全浓度为5.68 毫克/升。这要高于对虾类及沼虾类，与克氏原螯虾接近，说明红螯螯虾有在水质条件较差的环境中生存的能力。可是在红螯螯虾亲虾越冬过程中，氨氮的异常升高仍是一个重要的胁迫因子，因为当氨氮达到一定质量浓度时，红螯螯虾虽然不会死亡，但对其生长、蜕壳、摄食、繁殖、体质等都会产生影响。吕晓燕等(2010)认为氨氮要严格控制在一定范围内，以防氨氮胁迫对红螯螯虾机体的损害，因为氨氮胁迫不仅会引起虾体的中毒，也会严重降低虾的免疫力与抗病力。根据急性毒性试验中虾临死前的中毒表现，笔者猜测氨氮对红螯螯虾体内器官及生理生化水平均产生了负面影响。于是笔者在氨氮为0～2毫克/升范围内进行了肝胰腺组织切片的观察、抗氧化指标及免疫指标的检测，并认为红螯螯虾在一定质量浓度的氨氮环境下，其器官功能、抗氧化能力、免疫能力等均会产生变化。

首先，高氨氮导致的肝胰腺的生理功能受损是使虾生命力降低的重要原因。通过组织切片观察，肝小管上皮细胞的排列变得混乱，在中、高氨氮组，尤其在高氨氮组，细胞出现裂解，产生空泡化，证明了氨氮对肝胰腺的组织结构有损害，若长期处于此环境条件下，将影响其生理功能而致肝胰腺病变，进而破坏机体的新陈代谢，制约其越冬期间的生长及繁殖。

其次，不同氨氮条件下，红螯螯虾体内的抗氧化及免疫指标不同，从而导致虾的体质下降。本次研究表明，红螯螯虾的抗氧化指标、免疫相关指标及能量代谢相关指标均随氨氮质量浓度的升高而降低，其中高浓度氨氮组(2 毫克/升)的抗氧化能力、免疫相关指标均显著低于对照组(0 毫克/升)。有研究表明，在胁迫条件下，虾通过调节体内SOD 活性，从而减轻超氧化物自由基的损害，抑制脂质过氧化产物的积累，保护细胞免受氧化损伤。本试验结果显示，在氨氮为0～2毫克/升范围内，抗氧化指标SOD活性随氨氮质量浓度的升高而降低，而MDA则相反，随氨氮质量浓度的升高而升高，其中氨氮为1～2 毫克/升的SOD 值显著低于无氨氮胁迫组(P＜0.05)，氨氮为2毫克/升组的MDA 值显著高于其他组(P＜0.05)。因此，氨氮对红螯螯虾抗氧化系统有影响，这种损伤随着氨氮质量浓度的升高而加剧。本次研究与芦光宇等(2014)的研究结果相一致，即抗氧化酶活性随着氨氮胁迫水平增加表现出先激活后抑制的趋势，说明抗氧化酶既可因污染的暴露而产生适应性诱导反应，也可因污染的毒性作用而产生中毒反应，并推测这是造成红螯螯虾器官损伤的重要原因。ACP 和AKP 的活性变化能够一定程度指示机体的免疫状况。蒋琦辰等(2013)在对红螯螯虾的氨氮胁迫研究中发现，3 天胁迫后随着氨氮的升高，其活性的变化相似，高质量浓度组ACP及AKP的值都显著降低，并认为高氨氮胁迫能抑制免疫相关酶的活性，对免疫系统造成损害。本试验结果表明，4 个组的 ACP、AKP 值均差异显著(P＜0.05)，其中氨氮浓度为2 毫克/升组的值最低，因此笔者认为红螯螯虾机体的免疫力随氨氮质量浓度的升高而降低。

在进行红螯螯虾亲虾室内越冬时需要对水质进行定期监测，避免氨氮过高而影响机体的正常功能。当氨氮不稳定或突然升高时，必须进行针对性应对，当氨氮超过0.4 毫克/升，甚至超过1 毫克/升时，建议进行以下操作：首先是立即换水，快速降低氨氮质量浓度；其次，鉴于过高氨氮会导致机体抗氧化指标、免疫相关指标等的变化，可泼洒应激灵、免疫增强剂等产品，以降低亲虾的应激反应，保持亲虾生理生化指标的稳定；第三，鉴于过高氨氮会导致机体免疫力的降低及肝胰腺的损伤，可在投喂的饲料中掺入大蒜素、螺旋藻粉、多矿宝等提高机体免疫力及护肝的产品，以增强亲虾的抗病力及维持肝胰腺等脏器的正常工作；最后，可在水中加入EM 菌等进行调水，以稳定水质，避免氨氮再次升高。长期稳定、正常的氨氮质量浓度将有助于提高红螯螯虾亲虾的越冬成活率，并维护亲虾的体质，是亲虾顺利完成室内越冬的基础条件。