两个Ⅱ型神经纤维瘤病家系的临床表现及其与NF2基因突变的关系

曲喆，王兴杰，王玉芝

(聊城市第二人民医院 耳鼻咽喉科，山东 聊城 252600)

Ⅱ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 2,NF2)是由位于22号常染色体上的NF2基因突变导致的常染色体显性遗传的肿瘤易感综合征，发病率是1∶25 000[1]。NF2以神经系统肿瘤、皮肤肿瘤、晶体损害为临床特征。双侧听神经瘤为患者的特征性表现，见于90%的患者，患者会表现出耳鸣、听力下降、平衡功能异常等症状，颅内脑膜瘤、脊髓肿瘤、周围神经肿瘤和白内障亦常见[2-3]。近年来NF2的早期诊断越来越受重视，本病的早期诊断很大程度上依赖于基因诊断。

本实验对所掌握的两个NF2家系，收集家族成员的血液标本及临床资料，提取先证者的血液DNA，对NF2基因的15个外显子(从外显子1到15)及邻近的内含子序列进行聚合酶链反应(PCR)，对扩增产物进行直接测序，发现2个突变位点，对家族其他成员进行筛查，同期选取100名无血缘关系的健康者的血液DNA作为对照，从而确定突变基因携带者，对其进行监管。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 家系1 前往先证者居住地进行家系调查，对其家族成员进行现场体格检查和家系调查，绘制系谱图见图1。先证者为49岁女性，41岁时出现右耳耳鸣伴听力下降，43岁时出现左耳耳鸣伴听力下降，45岁时出现右侧头部钝痛伴走路不稳感。查体：营养中等，体表未见牛奶咖啡斑，闭眼露白，呲牙不可，鼓腮漏气，抬眉不能，H-B评级III级。2007年患者于北京同仁医院行中颅窝入路右侧听神经瘤切除术，2009年于解放军四六三医院行左侧听神经瘤伽马刀治疗。内听道核磁检查见图2，示双侧听神经瘤，符合NF2临床表现。家族中其他成员的临床表现见表1。

图1 家系1系谱图 ■和●分别代表家系男、女患者；□和○分别代表家系健康男性、女性；箭头指示为先证者，斜杠代表死亡者

图2 家系1先证者内听道MRI 2a：冠状位T2WI显示双侧内听道及桥脑小脑角区内不均匀等信号肿块影； 2b：水平位增强后T1WI显示双侧内听道及桥脑小脑角区内肿块明显不均匀强化

1.1.2 家系2 前往先证者居住地进行家系调查，对其家族成员出进行现场体格检查和家系调查，绘制系谱图见图3。

表1 家系中其他患者的临床表现

图3 家系2系谱图 ■和●分别代表家系男、女患者；□和○分别代表家系健康男性、女性；箭头指示为先证者，斜杠代表死亡者

先证者于北京同仁医院2000年行经迷路进路左侧听神经瘤切除术，2001年行扩大经迷路进路右侧听神经瘤切除术，第1次术后预后良好，第2次术后死亡，未获得先证者血液标本。

Ⅲ4为21岁男性青年，于17岁时出现左耳听力下降、耳鸣、声音嘶哑，2008年行内耳MRI检查示双内听道、桥脑小脑角区、三叉神经走形区、海绵窦内、延髓两侧迷走神经、副神经、舌下神经走形区及颈椎椎管内占位性病变，脑干及小脑受压变形，影像见图4。

图4 家系2Ⅲ4内耳MRI 4a：水平位增强后T1WI显示双侧内听道及桥脑小脑角区肿块不均匀强化； 4b：冠状位T2WI显示双侧内听道及桥脑小脑角区内不均匀高信号肿块影(箭头所示)

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 5 mL静脉血加K2EDTA抗凝，使用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒(非离心柱型)提取DNA。经紫外光光度计进行纯度测定 OD260/ODC280为1.8-2.0。

1.2.2 PCR扩增反应 PCR反应体系25 μL，含模板DNA2.0 μL，正反引物各1.5 μL，PCRMIX12.5 μL，过滤水7.5 μL，在PCR仪上扩增30个循环，变性温度94℃ 3 min，退火温度(45～60)℃30 s，延伸温度72℃ 1 min，最后一次反应结束后72℃延伸5 min。反应结束后取5 μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。15对引物使用Primer 5.0软件设计，扩增片段包括每个外显子及两端部分内含子。引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司完成。

1.2.3 DNA序列分析 将合格的PCR扩增产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。

2 结果

2.1 家系1

对先证者的NF2基因的1-15外显子及临近内含子做直接测序，发现内含子2剪接供体位点g>t杂合性碱基点突变。对外显子2的突变为反向测序，因此直接测序图上可见c>a突变(图5)家系中患病的Ⅲ6、Ⅲ10、Ⅳ9、Ⅳ11、Ⅲ1、Ⅲ3及尚未发病Ⅳ2、Ⅳ5、Ⅳ6均发现与先证者相同突变，家系中的其他成员及100名无血缘关系健康对照者均未发现此突变，与临床诊断一致。

图5 家系1 NF2基因测序结果反向测序可见c>a突变，箭头指向点突变

2.2 家系2

对先证者之子Ⅲ4的NF2基因的1-15外显子及临近内含子做直接测序，发现内含子7剪接受体位点a>g的杂合性碱基点突变。对外显子8的直接测序为正向测序，因此直接测序图谱上可见a>g突变及反向t>c突变(图6)。先证者之女Ⅲ3未携带此突变。

图6 家系2 NF2基因测序结果 a:直接测序图谱上可见a>g突变，箭头指向点突变； b:反向测序图谱上可见t>c突变，箭头指向点突变

3 讨论

NF2基因为肿瘤抑制基因，在1993年被定为在染色体22q12上[4-5]，长度大约110 Kb，包括17个编码外显子。与Alfred Knudson’s的肿瘤形成2次打击学说相一致，即2个等位基因均失活才引发肿瘤[6-7]。第1次突变源自遗传或源自胚胎期新发生的突变，第2次突变发生在敏感靶器官细胞中另一个等位基因突变失活，继而肿瘤发生。NF2基因编码含有595个氨基酸的Merlin蛋白，被认为是一种肌动蛋白相关蛋白，在细胞骨架和细胞膜之间起连接作用，merlin蛋白存在2种亚基，但只有亚基1能够形成肿瘤抑制作用的折叠蛋白[8]。NF2基因在胚胎和成人的Schwann 细胞、脑脊膜的细胞、晶体和神经中高水平表达。因此突变时以神经系统、晶体损害和皮肤肿瘤为特征。神经系统的肿瘤主要表现为双侧听神经瘤，其他为脑神经的神经鞘瘤、脑脊膜瘤、脊髓的髓内髓外肿瘤、周围神经病变等。眼睛的损害以白内障、视网膜错构瘤为主要表现。皮肤的主要表现为皮肤神经纤维瘤、皮肤咖啡斑。

NF2基因突变的位点和方式，与NF2患者的临床症状、疾病严重程度关系密切。同一家族的患者之间，临床表现存在一定的相似性，但不同家族之间的患者临床表现存在较大差异[9]。当NF2基因出现错义突变、框架内缺失突变或大片段缺失时，会造成Merlin 蛋白功能部分缺失，临床症状相对较轻；而当NF2基因发生无义突变或移码突变时，会导致Merlin蛋白功能完全丧失，使患者出现更加严重的临床表现[10]。此外，1-5号外显子区域突变比11-15号外显子突变的患者发病更严重，但不同区域剪接位点突变的病情轻重不一[11-12]。

本研究对NF2基因的编码区及其邻近内含子序列进行了PCR扩增和DNA测序，在两个家系中发现了两个突变位点，分为内含子2剪接供体位点g>t的突变和内含子7剪接受体位点a>g的突变。该突变在国内外均未见报道，属于新的突变位点，进一步显示NF2基因突变谱的多样性。在家系内突变与表型存在一一对应关系，即与疾病表现型共分离现象。对100名无血缘关系的健康对照者的内含子2剪接供体和内含子7剪接受体处进行测序，未发现该突变，使得检查结果的可靠性、可信度增加，并且排除了该基因位点多态性的可能。外显子和内含子的相邻序列很保守，外显子3’端与内含子5’端交界处，内含子的两个碱基通常为GT，为剪接供体位点；外显子5’与内含子3’端交界处，内含子的两个碱基通畅为AG，为剪接受体位点。成熟的mRNA需经过剪接、拼接等步骤除去基因中的内含子成分，保留有编码功能的序列。Ahronowitz等[13]将发生在-2到-1和+1到+5位点的突变归为剪接位点突变。大多数(91/99)的突变落在上述的GT-AG序列中，86%的剪接位点的改变位于内含子序列，相反只有14%位于外显子。内含子内的突变，通常被归为有未知作用的突变，除非有明确的RNA证据来证明。目前cDNA分析的缺乏可能会使得发生在GT-AG序列外的剪接位点突变被低估。

通过此实验，发现NF2基因的致病突变必然引起NF2的发生，同一家族发病年龄接近。对于此研究中的两个家系，找到了NF2基因的突变位点，针对此突变对家族内成员进行筛查，分出了突变携带者和未携带者。对突变未携带者，排除了其患病可能，解除其沉重的精神负担及进行医学检查的经济负担。对未发病的携带者，每年定期MRI及听力学检查，使其早期诊断，得到及时正确的治疗，改善疾病预后。另外，分子遗传学诊断的另一个重要意义就是将来对家系中有需求的患者进行产前诊断，以避免相同疾病的再发。