荧光定量PCR检测牛瑟氏泰勒虫方法的建立

王轶男 ， 胡诗悦 ， 陈洪涛 ， 金春梅 ， 金 一 ， 于龙政

(1.延边大学农学院 ， 吉林 延吉 133002 ； 2. 长春市动物疫病预防控制中心 ， 吉林 长春 130000 ；3. 山东省新泰市泉沟镇人民政府 ， 山东 新泰 271207)

牛瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti)是一种泰勒属的血液原虫，通过破坏红细胞发挥致病作用[1]。病牛早期出现不愿行走、虚弱等症状，重症病例出现黄疸、食欲废绝、不能站立等严重症状[2]。伴随养牛产业的扩大，在我国不同地理区域不断发现牛瑟氏泰勒虫感染。肉牛产业是吉林省近年来的重点发展产业，因此要有效防治该病的发生，减少和降低养牛业的损失。P33基因是牛瑟氏泰勒虫的功能基因，基因序列全长868 bp[3]。

牛瑟氏泰勒虫免疫学检测方法主要包括间接免疫荧光试验(IFA)、乳胶凝集试验(LA)、平面聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、分子生物学诊断等[4-6]。用以上方法都能诊断出该病，但仍存在特异性较差、敏感性较低、扩增产物的污染导致假阳性等问题，因此不能有效防控该病。鉴于上述原因，本试验旨在建立牛瑟氏泰勒虫的TaqMan荧光定量PCR和SYBR Green荧光定量PCR检测方法，为其快速检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 样本 采集吉林省延边朝鲜族自治州1个规模养牛场的牛血液样品作为检测血样，并于-20 ℃冷冻保存。

1.2 主要试剂 Blood DNA Midi Kit、Plasmid Maxi Kit、Gel Extraction Kit等，均购自OMEGA Bio-Tek生物技术公司；rTaqDNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、pMD 18-T Vector克隆载体、SYBRPremixExTaqⅡ、PremixExTaq等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计和合成 本试验应用软件Primer Express设计引物，并根据荧光定量PCR引物和探针设计原则，用软件Primer Premier和Oligo分别评估引物和探针。其中选择FAM作为探针5′端标记荧光报告基团，选择TAMRA作为探针3′端标记荧光淬灭基团。同时参考Yu等[2]推荐的常规PCR引物序列。引物和探针序列见表1，均由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 PCR和real-time PCR所用的引物核苷酸序列Table 1 Details of primers for PCR and real-time PCR

1.4 试验方法

1.4.1 标准品的制备和鉴定 提取虫体阳性全血基因组DNA，并以阳性DNA为模板，利用表1中Ts-TaqMan-F和Ts-TaqMan-R为引物(Ts-TaqMan-F/Ts-TaqMan-R和Ts-SYBR-F/Ts-SYBR-R是扩增同一片段)进行常规PCR扩增。PCR反应体系25 μL：10×ExTaqBuffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 16.25 μL，ExTaqDNA聚合酶 0.25 μL。扩增条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 45 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，30个循环；再延伸72 ℃ 7 min。PCR产物符合预期片段大小的回收纯化，4 ℃过夜条件下连接到pMD-18T Vector载体，转化至E.coliDH5α 感受态细胞中培养后提取质粒DNA。然后对重组质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定。构建的重组质粒检测浓度并计算拷贝数后作为标准品。

1.4.2 标准曲线的建立及敏感性试验 将质粒标准品按10倍倍比梯度稀释为109～100copies/μL，各取1 μL进行扩增。SYBR Green方法中20 μL最佳反应体系：SYBR PremixExTaq10 μL，上、下引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环。探针方法中20 μL最佳反应体系：ExTaq12.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL,上、下引物各0.8 μL，探针0.6 μL，模板2 μL，ddH2O 3.1 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环。使用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪Mx3005P进行荧光定量PCR检测，以每个稀释度质粒模板拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，生成标准曲线，同时确定建立方法可检测到的最低拷贝数以确定其敏感性。

1.4.3 特异性试验 以犬新孢子虫(Neosporacaninum)、附红细胞体(Mycoplasmasuis)、弓形虫(Toxoplasmagondii)的DNA作为模本，以瑟氏泰勒虫的DNA作为阳性对照进行荧光定量PCR的检测，绘制出特异性试验的扩增曲线。

1.4.4 重复性试验 选取不同拷贝数的标准品分别进行3组，每个梯度设3个重复进行试验，测定批内变异系数和批间变异系数，以评估建立方法的稳定性。

2 结果

2.1 标准品的制备和鉴定 利用克隆引物进行常规PCR扩增，如图1所示，得到与预期一致的101 bp片段。将重组质粒进行PCR鉴定和测序对比，结果均与预期相符，标准质粒构建成功，见图2。测定质粒浓度，计算拷贝数为2.26×1010copies/μL，进行10倍倍比稀释成2.26×1010～2.26 copies/μL。

图1 P33基因扩增结果Fig.1 PCR product of P33 gene M:DNA marker DL2 000; 1:P33基因; 2:阴性对照M:DNA marker DL2 000; 1:P33 gene; 2:Negative control图2 标准质粒构建Fig.2 Construction of standard plasmidM:DNA marker DL2 000; 1:阳性对照; 2:阴性对照M:DNA marker DL2 000; 1:Positive control; 2:Negative control

2.2 标准曲线的建立及敏感性试验 用标准质粒10倍倍比稀释作为模板进行SYBR Green荧光定量PCR的扩增，由图3可知，生成典型S型的扩增曲线且灵敏度为2.26 copies/μL。在2.26×108～2.26×101copies/μL范围内具有较好的线性关系，Ct值(y)与样品初始拷贝数(x)的标准曲线方程：y=-3.314x+38.34(相关系数R2=0.993，扩增效率E=100.3%)。如图4所示，熔解曲线的熔解温度Tm为(83.1±0.5)℃，无引物二聚体及非特异产物，且只有单一特异峰。用标准质粒10倍倍比稀释作为模板进行TaqMan荧光定量PCR的扩增，如图5所示，生成典型S型的扩增曲线且灵敏度为2.26 copies/μL。在2.26×108～2.26×101copies/μL范围内具有较好的线性关系，Ct值(y)与样品初始拷贝数(x)的标准曲线方程：y=-3.509x+42.93(相关系数R2=0.996，扩增效率E=92.7%)。

图3 SYBR Green PCR 方法的建立Fig.3 Establishment of SYBR Green PCRA:扩增曲线； B:标准曲线A:Amplification curve; B:Standard curve1:2.26×108copies/μL； 2:2.26×107copies/μL； 3:2.26×106copies/μL； 4:2.26×105copies/μL； 5:2.26×104copies/μL；6:2.26×103copies/μL； 7:2.26×102copies/μL； 8:2.26×101copies/μL； 9:2.26 copies/μL

图4 SYBR Green PCR 熔解曲线Fig.4 Dissociation curve of SYBR Green PCR

图5 TaqMan PCR 方法的建立Fig.5 Establishment of TaqMan PCRA:扩增曲线； B:标准曲线A:Amplification curve; B:Standard curve1:2.26×108copies/μL； 2:2.26×107copies/μL； 3:2.26×106copies/μL； 4:2.26×105copies/μL； 5:2.26×104copies/μL；6:2.26×103copies/μL； 7:2.26×102copies/μL； 8:2.26×101copies/μL； 9:2.26 copies/μL

2.3 特异性试验 分别用N.caninum、M.suis、T.gondii和3个不同浓度标准品的DNA作为样本进行2种荧光定量PCR方法的特异性试验。如图6和图7所示，均未出现非特异性扩增曲线，证明针对P33的引物具有较好的特异性。且SYBR Green PCR方法得到的熔解曲线在83 ℃出现单一特异峰，无引物二聚体等，见图6。

图6 SYBR Green PCR 特异性分析Fig.6 Specificity of SYBR Green PCRA:扩增曲线； B:熔解曲线A:Amplification curve； B:Dissociation curve1～3:TsP1质粒; 4:弓形虫; 5:附红细胞体; 6:新孢子虫1-3:TsP1 plasmid; 4:Toxoplasma gondii; 5:Mycoplasma suis; 6:Neospora caninum

图7 TaqMan PCR 特异性分析Fig.7 Specificity of TaqMan PCR1～3:TsP1质粒; 4:新孢子虫; 5:弓形虫; 6:附红细胞体1-3:TsP1 plasmid; 4:Neospora caninum; 5:Toxoplasma gondii; 6:Mycoplasma suis

2.4 重复性试验 SYBR Green 荧光定量PCR方法的批内和批间重复性试验是通过选取2.26×108、2.26×104copies/μL和2.26 copies/μL三个不同稀释度的质粒来评估的。批内结果CV值介于0.95%～3.24%，见表2；批间结果CV值介于1.06%～3.54%，见表3。2个试验的CV值均小于4%。

表2 SYBR Green PCR 批内试验Table 2 Intra-assay variability of SYBR Green PCR

表3 SYBR Green PCR 批间试验Table 3 Inter-assay variability of SYBR Green PCR

TaqMan荧光定量PCR方法的批内和批间重复性试验是通过选取2.26×108、2.26×105copies/μL和2.26×103copies/μL三个不同稀释度的质粒来评估的。批内结果CV值介于1.61%～1.98%，见表4；批间结果CV值介于1.37%～3.04%，见表5。2个试验的CV值均小于4%。

表4 TaqMan PCR 批内试验Table 4 Intra-assay variability of TaqMan PCR

表5 TaqMan PCR 批间试验Table 5 Inter-assay variability of TaqMan PCR

3 讨论

牛瑟氏泰勒虫是通过寄生在红细胞内引起红细胞破裂和溶血的牛血液原虫，在我国吉林省、甘肃省、贵州省等多个地区均存在[1,7-8]。牛瑟氏泰勒虫呈低致病性，在本地牛群中表现为带虫感染，临床症状不明显，但对外地引进牛的感染率和致死率很高，同时临床症状较为明显[7]。荧光定量PCR由于其简单、稳定、快速且准确的特点，在分子生物学各个领域广泛应用[9]。本试验通过牛瑟氏泰勒虫P33基因分别设计特异性引物和探针，成功建立SYBR Green和TaqMan荧光定量PCR检测方法。

本试验所建立的2种荧光定量方法在拷贝数2.26×108～2.26 copies/μL范围内都能检测到，均呈现典型S型曲线。2种荧光定量PCR方法检测灵敏度均为2.26 copies/μL；特异性试验中阴性对照均无扩增曲线；重复性试验中批内和批间CV值均小于4%。

综上所述，本试验建立的牛瑟氏泰勒虫荧光定量PCR方法具有很好的敏感度、特异性及重复性，为牛瑟氏泰勒虫的鉴别提供一种快速检测的技术参考。