过表达microRNA-224骨髓间充质干细胞对大鼠坐骨神经损伤的作用及其机制研究*

胡安全，王正安，秦力，李哲，冯祁军

（嘉兴市第一医院 骨科，浙江 嘉兴314000）

坐骨神经损伤是一类临床上常见的神经损伤疾病，常与髋关节脱位、髋臼骨折等外伤并存，以车祸、工伤较为常见[1-2]。坐骨神经损伤恢复较慢，若治疗不当，可引起肢体瘫痪，造成患者严重残疾。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC）是一类源自骨髓基质的成体干细胞，具有自我复制能力和多向分化潜能[3-4]。大量研究表明，BMMSC能够诱导分化为神经元样细胞，对坐骨神经损伤具有一定的修复作用[4-5]。然而，绝大部分BMMSC在移植后迅速凋亡，不能充分发挥其修复功能。目前，提高BMMSC的治疗潜能是基础与临床研究的热点问题。

MicroRNA（miRNA）是一类广泛存在于真核生物体内的非编码RNA，具有多种生物学功能，在坐骨神经损伤的发病过程中发挥重要作用[6-7]。既往研究表明，转染microRNA-224（miR-224）可以提高移植后BMMSC 的存活能力，增强BMMSC 治疗卵巢早衰的效果[7]。然而，尚不清楚miR-224 转染能否增强BMMSC 对坐骨神经损伤的治疗作用。因此，本实验将过表达miR-224 的BMMSC 移植至大鼠坐骨神经，评估miR-224 联合BMMSC 对坐骨神经损伤的治疗作用，并探索相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

8～9 周龄SPF 级雄性Sprague Dawley（SD）大鼠购自北京华阜康生物技术有限公司。miR-224 慢病毒载体由山东维真生物科技有限公司构建，并进行鉴定。间充质干细胞培养基和DEME 培养基购自美国Gibco 公司，CD29、CD34、CD45 和CD90 抗体购自美国R&D 公司，凋亡检测试剂盒购自德国Roche公司，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、髓鞘碱性蛋白（myelinbasicprotein,MBP）、生长相关蛋白-43（growth associated protein,GAP-43）和甘油醛-3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗体购自美国Abcam 公司。

1.2 BMMSC的分离、培养、鉴定及转染

将SD 大鼠麻醉后置于无菌冷冻台上，快速分离股骨和胫骨，剪开两端骨髓后收集骨髓，制备成单细胞悬液。加入Percoll 分离液，离心后收集中间层的单个核细胞，将重悬后的细胞接种在间充质干细胞专用培养基中，利用流式细胞仪检测BMMSC表面CD29、CD34、CD45和CD90的表达，可见CD29和CD44高表达，CD34和CD45低表达。将BMMSC分为3 组：BMMSC 组（坐骨神经损伤+BMMSC）、LVBMMSC 组（坐骨神经损伤+LV-BMMSC） 和miR-224-BMMSC 组（坐骨神经损伤+miR-224-BMMSC），其中，BMMSC 组不给予任何处理，LV-BMMSC 组加入慢病毒空载体液，转染48 h；而miR-224-BMMSC组加入miR-224 慢病毒载体液，转染48 h。每个实验设置5 个复孔，重复3 次。

1.3 qRT-PCR检测miR-224转染情况

转染48 h 后，提取总RNA，使用逆转录试剂盒将miRNAs 逆转录为cDNA，并配置PCR 反应体系。采用qRT-PCR，以U6 作为内参，检测miR-224 的转染情况。扩增条件：94℃预变性30 s，94℃变性15 s，55℃退火10 s，72℃延伸20 s，共计40 个循环。实验重复3 次，采用2-△△Ct法计算miR-224 相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 模型的复制与分组

将SD 大鼠随机分为5 组：假手术组、模型组、BMMSC组（坐骨神经损伤+BMMSC）、LV-BMMSC组（坐骨神经损伤+LV-BMMSC）和miR-224-BMMSC 组（坐骨神经损伤+miR-224-BMMSC），每组各15只。后4组均利用钳夹法复制坐骨神经损伤模型，具体操作步骤如下：将SD大鼠麻醉后固定在鼠板上，分离皮肤和肌肉，暴露坐骨神经，利用血管夹钳夹坐骨神经，10 s后松开，反复钳夹3次。以显微镜下可见神经轴突中断、外膜连续为模型复制成功。而假手术组除不钳夹坐骨神经外，其余步骤同上。模型复制完成后，BMMSC组在神经损伤处注射1.5×106个BMMSC，LVBMMSC 组在神经损伤处注射1.5×106个LV-BMMSC，miR-224-BMMSC 组在神经损伤处注射1.5×106个miR-224-BMMSC。

1.5 BBB运动评分量表评估运动功能

分别在手术当天、术后第12 天和第24 天评估各组大鼠的运动功能。BBB运动评分量表范围为0～24 分，分数越高，表示运动功能越好。

1.6 坐骨神经功能测定

制作一个10 cm×10 cm 的足印行走盒，将所有大鼠的双足蘸满墨水，放在盒中，使其自由行走。分别在手术当天、术后第12 天和第24 天检测足趾宽度、足印长度和宽度，计算坐骨神经功能指数（sciatic functional index,SFI）。其中，SFI=0 为正常，SFI=100 为坐骨神经完全损伤。

1.7 Western blotting

术后第24 天麻醉大鼠，切除坐骨神经，PBS 清洗后提取总蛋白。利用SDS-PAGE 凝胶分离蛋白，湿转法将蛋白转移至PVDF 膜，TBST 洗涤3 次。封闭后将PVDF 膜置于一抗孵育盒中，4℃避光孵育。一抗孵育后向孵育盒中加入HRP 标记二抗，室温孵育1 h。利用凝胶成像仪对PVDF 膜进行灰度值扫描，以GAPDH为内参，检测BDNF、MBP和GAP-43蛋白相对表达量，实验重复3 次。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡

术后第24 天麻醉大鼠，切除坐骨神经，制成组织匀浆。离心后弃上清，加入70%乙醇固定，PBS 清洗3 次。依次加入Annexin V-FITC 和PI 染色液，混匀后避光孵育10 min，置于流式细胞仪上检测，实验重复3 次。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞miR-224转染情况

BMMSC组、LV-BMMSC组、miR-224-BMMSC组BMMSC 细胞miR-224相对表达量分别为（1.00±0.24）、（1.07±0.19）和（5.34±0.29），经方差分析，差异有统计学意义（F=625.517，P=0.000）；miR-224-BMMSC组高于BMMSC组和LV-BMMSC组（P＜0.05）。

2.2 运动功能评估

假手术组、模型组、BMMSC 组、LV-BMMSC组、miR-224-BMMSC 组大鼠术后第12 天和第24 天BBB 评分比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点大鼠的BBB 评分有差异（F=139.685，P=0.000）；②各组大鼠的BBB 评分有差异（F=105.341，P=0.000），术后第12天和第24天，模型组低于假手术组（P＜0.05），BMMSC 组高于模型组（P＜0.05），miR-224-BMMSC 组高于BMMSC 组（P＜0.05）；③各组大鼠的BBB评分变化趋势有差异（F=43.627，P=0.000）。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点的BBB评分比较（n=15，±s）

表2 各组大鼠不同时间点的BBB评分比较（n=15，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与BMMSC组比较，P ＜0.05。

术后第24天组别手术当天术后第12天20.92±0.26 8.32±0.84①15.15±0.93②15.37±0.76②18.75±0.96②③假手术组模型组BMMSC组LV-BMMSC组miR-224-BMMSC组20.87±0.23-- - -20.94±0.15 5.21±0.51①10.87±0.66②10.22±0.59②14.64±0.71②③

2.3 坐骨神经功能比较

假手术组、模型组、BMMSC 组、LV-BMMSC组、miR-224-BMMSC组大鼠手术当天、术后第12天和第24 天测量的SFI 比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点大鼠的SFI有差异（F=86.427，P=0.000）；②各组大鼠的SFI 有差异（F=43.646，P=0.000），术后第12 天和第24 天，模型组高于假手术组（P＜0.05），BMMSC 组低于模型组（P＜0.05），miR-224-BMMSC 组低于BMMSC 组（P＜0.05）；③各组大鼠的SFI 变化趋势有差异（F=23.595，P=0.000）。见表3。

表3 各组大鼠不同时间点SFI比较 （n=15，±s）

表3 各组大鼠不同时间点SFI比较 （n=15，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与BMMSC 组比较，P ＜0.05。

组别手术当天术后第12天术后第24天假手术组模型组BMMSC组LV-BMMSC组miR-224-BMMSC组0.69±0.04 20.49±1.21①19.65±0.84 20.74±1.04 21.26±0.95 0.64±0.05 16.21±0.41①10.66±0.56②10.22±0.59②6.25±0.42②③0.72±0.04 14.56±0.44①5.14±0.37②5.39±0.32②1.21±0.12②③

2.4 各组大鼠坐骨神经组织蛋白相对表达量比较

各组大鼠坐骨神经组织BDNF、MAP和GAP-43蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；miR-224-BMMSC组高于模型组、BMMSC组和LV-BMMSC组（P＜0.05）。见表4和图1、2。

表4 各组大鼠BDNF、MAP、GAP-43蛋白相对表达量比较 （n=15，±s）

表4 各组大鼠BDNF、MAP、GAP-43蛋白相对表达量比较 （n=15，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与BMMSC 组比较，P ＜0.05。

GAP-43组别BDNF MAP 1.00±0.13 1.75±0.16①2.67±0.19②2.73±0.22②3.67±0.24②③141.279 0.000假手术组模型组BMMSC组LV-BMMSC组miR-224-BMMSC组F 值P 值1.00±0.14 1.46±0.17①2.13±0.19②2.03±0.18②2.83±0.21②③75.183 0.000 1.00±0.12 1.64±0.15①2.34±0.17②2.45±0.19②3.05±0.22②③104.125 0.000

图1 各组大鼠BDNF、MAP、GAP-43蛋白的表达

2.5 凋亡结果比较

假手术组、模型组、BMMSC组、LV-BMMSC组、miR-224-BMMSC 组大鼠BMMSC 凋亡率分别为（2.02±0.23）%、（19.47±1.69）%、（10.31±1.23）%、（10.92±1.05）%和（4.68±0.47）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=197.246，P=0.000）；miR-224-BMMSC 组低于模型组、BMMSC 组 和LV-BMMSC 组（P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠BMMSC流式细胞图

3 讨论

近年来，随着社会经济的发展，交通事故伤日渐增多，坐骨神经损伤的发生率也逐渐增高。坐骨神经损伤恢复较慢，若治疗不当，可引起肢体瘫痪，造成严重残疾[8-9]。神经钳夹是一种经典的坐骨神经损伤模型，利用钳夹造成坐骨神经的轴突断裂，但神经外膜的连续性不受破坏[8]。本研究利用血管夹钳夹坐骨神经，诱导大鼠坐骨神经损伤。模型组大鼠手术当天出现下肢瘫痪，运动功能丧失，BBB 评分为0 分，SFI 也显著升高。这些结果表明，本研究成功复制大鼠坐骨神经损伤模型，为下一步研究奠定了基础。

BMMSC 具有多向分化潜能，可在损伤部位分化为特定的细胞类型，通过重建组织微环境，增加细胞功能，参与组织的修复过程[10-11]。研究表明，BMMSC 能够诱导分化为神经元样细胞，修复损伤的坐骨神经，部分改善神经功能，但不能完全修复损伤的坐骨神经[12]。进一步研究证实，移植后BMMSC 快速凋亡是影响其疗效的主要原因之一。绝大部分BMMSC 在移植后4 d 内快速凋亡，移植后存活率仅为10%～20%[13-14]。因此，提高BMMSC 移植后存活率，降低其凋亡可有效提高BMMSC 的疗效。

miR-224 是新近发现的内源性非编码RNA，通过调控细胞的分化、增殖和凋亡，发挥多种生物学功能[15]。王家云等[16]的研究表明，miR-224 具有促进细胞增殖、抗细胞凋亡作用，是胶质瘤干细胞发挥凋亡抗性的重要驱动因素。蒋来等[7]的研究也证实，过表达miR-224 可以提高BMMSC 移植后的存活能力，进一步改善BMMSC 移植对卵巢早衰的治疗作用。因此，笔者将miR-224 的抗凋亡作用与BMMSC的修复效应相结合，通过将过表达miR-224的BMMSC 移植回损伤部位，探究其对坐骨神经损伤的治疗作用。

BBB 评分和SFI 是常用的坐骨神经功能评估指标。本研究结果表明，将过表达miR-224 的BMMSC移植回受损的坐骨神经，与BMMSC 或LV-BMMSC移植比较，miR-224-BMMSC 组大鼠BBB 评分明显升高，SFI 降低，提示过表达miR-224 的BMMSC 可进一步促进坐骨神经功能恢复，改善运动功能。此外，miR-224-BMMSC 移植可上调BDNF、MAP 和GAP-43 蛋白的表达，促进坐骨神经的再生与修复。流式细胞术的结果也表明，miR-224 转染可显著提高移植后BMMSC 在体内的存活率，修复损伤的坐骨神经。上述结果表明，miR-224 联合BMMSC 具有更强大的神经修复效果。

综上所述，与单一BMMSC 移植相比，过表达miR-224 的BMMSC 具有更强大的神经修复作用，可进一步改善钳夹伤引起的坐骨神经损伤。本研究为临床防治坐骨神经损伤提供了新的思路和理论依据。但过表达miR-224 的BMMSC 能否通过其他机制发挥保护作用，以及如何将过表达miR-224的BMMSC 应用于坐骨神经损伤患者的临床治疗，仍需进一步深入研究。