视网膜前体细胞移植对缺血再灌注损伤大鼠视网膜形态影响的实验研究

李雪颖，李 静，张红梅，周 蓉

(陕西省人民医院，陕西 西安 710068)

缺血再灌注损伤是在缺血基础上恢复血流后，组织器官损伤反而加重的现象[1]，是眼科常见的病理过程，常见于青光眼急性大发作降眼压治疗过程、视网膜血管栓塞性疾病的溶栓治疗过程以及影响视网膜血流的各种眼科手术过程中[2]。视网膜缺血后再灌注可引起视网膜神经元细胞坏死、凋亡，视网膜萎缩变薄[3]，也可以使Müller细胞过度活化[4]、小胶质细胞活化以及大量炎性因子生成[5]，激活氧化应激反应[6]，从而造成视网膜损伤，导致严重的视觉障碍。视网膜缺血再灌注(Retinal ischemia-reperfusion，RIR)损伤指缺血性眼病患者的视网膜在恢复供血后出现明显的功能障碍，甚至发生不可逆性损伤，再灌注并不缓解视网膜细胞的损伤，反而加剧了细胞的死亡[7]。目前对于视网膜缺血再灌注损伤的治疗主要为辅助的药物治疗，细胞移植治疗方法经过多年研究还是处于实验室探索阶段。本研究拟通过观察模型大鼠视网膜前体细胞(Retinal progenitor cells，RPCs)移植后缺血再灌注损伤视网膜形态的改变，为新临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级2月龄雄性SD大鼠，体重200～250 g，无眼疾，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。动物饲养保持12 h昼夜交替的生物节律，室温保持在20～24 ℃，每日定时清洗笼舍。实验动物能自由饮用水和食物。将56只SD大鼠随机分为对照组(未做任何处理)、假手术组(只做前房穿刺，sham组)、前房灌注模型组(RIR组)、视网膜前体细胞视网膜下腔移植组(前房灌注后视网膜下腔移植视网膜前体细胞，RIR+R-C组)、PBS视网膜下腔移植组(前房灌注后视网膜下腔移植PBS，RIR+R-PBS组)、视网膜前体细胞上丘移植组(前房灌注后上丘移植视网膜前体细胞，RIR+SC-C组)与PBS上丘移植组(前房灌注后上丘移植PBS，RIR+SC-PBS组)，每组8只。

1.2 主要试剂 兔抗大鼠Thy-1多克隆抗体(批号：sc-9163；Santa cruz biotechnology公司)；兔抗大鼠PKC多克隆抗(批号：ab71558；Abcam公司)；小鼠抗大鼠视紫红质多克隆抗体(批号：ab190307；Abcam公司)；Cy3标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG；5%山羊血清；Triton X-100；甘油。

1.3 主要仪器 荧光显微镜(日本Olympus DP71)；Ts-2型脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；电生理仪(德国罗兰公司)；SAE-200电子天平(德国Heraeus公司)；鼠用立体定位仪；5 μl微量注射器；微型电钻。

1.4 细胞分离培养 ①无菌条件下，断头处死新生大鼠，取头部浸泡在盛有0.1 mol/L PBS的培养皿中，0.1 mol/L PBS冲洗2遍。②分离出眼球，放入含少量DMEM/F12基础培养基的培养皿中。③解剖显微镜下去除眼球外结缔组织。④沿角巩膜缘剪去角膜，用虹膜恢复器及镊子小心去除晶状体和玻璃体。⑤视网膜神经上皮与色素上皮层可在操作过程中自动剥离。使用虹膜恢复器仔细剥取视网膜神经上皮层，置于含少量完全培养基的小平皿内。用小剪刀将视网膜神经上皮层尽量剪碎成匀浆，加入少量完全培养基，用玻璃吸管吹打40～60次后过200目筛网，制成单细胞悬液。⑥用小剪刀将视网膜神经上皮层尽量剪碎成匀浆，加入少量完全培养基，用玻璃吸管吹打40～60次，过200目筛网，制成单细胞悬液。⑦台盼蓝染色计数，调整细胞密度为2×105/ml，接种细胞悬液于培养瓶。于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的CO2孵育箱中培养，隔天加1～2 ml完全培养基。⑧培养7 d后传代。使用玻璃吸管将细胞悬液转移至离心管，用基础培养基洗涤培养瓶2次，将洗涤液移入离心管，1200 r/min离心5 min，弃上液后加入1 ml消化液，37 ℃孵育5 min后使用玻璃吸管吹打40次左右，再次1200 r/min离心5 min后弃上液，加入完全培养基重悬细胞，按照2×105/ml的密度接种于培养瓶，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的CO2孵育箱中培养。

1.5 腺相关病毒8(Adeno-associated virus8，AAV-8)转染视网膜前体细胞 传代后将视网膜前体细胞以1×105/ml的密度接种于含完全培养基的培养瓶中，以1∶100的比例加入相应的AAV-8病毒液，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的CO2孵育箱中培养72 h后收集转染的细胞，用0.01 mol/L PBS洗2次。将细胞以1×104/ml的密度接种于含完全培养基的培养瓶中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的CO2孵育箱中培养7 d。

1.6 大鼠RIR损伤动物模型制作 大鼠称重后，给予10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔内注射麻醉。麻醉后，将大鼠固定在自制载物板上。左眼局部消毒，生理盐水与氧氟沙星眼药水清洁结膜囊。将4.5号头皮针自大鼠颞侧角膜缘穿刺入眼前房进行灌注，注意勿伤及虹膜和晶状体。胶布固定穿刺针头于定位仪上，接通预先连接好的生理盐水输液瓶，将输液瓶高度升高到150 cm，压力为150 cmH2O。观察可见球结膜苍白，虹膜迅速变白，生理盐水保持角膜湿润。持续前房灌注加压造成视网膜缺血60 min后，缓慢降压至正常水平，拔出穿刺针头，虹膜及球结膜颜色迅速恢复正常，结膜囊滴氧氟沙星眼药水预防感染。松解大鼠，让其自行苏醒。对照组不做任何处理。

1.7 视网膜下腔细胞移植 将大鼠固定在自制载物板上，使术眼朝向正上方。常规表面麻醉、铺巾，在2点钟方位用显微有齿镊提起球结膜及其下筋膜，再用显微剪打开一小缺口，钝性分离球结膜及其下筋膜，暴露巩膜；在角巩缘后3 mm做浅层巩膜切口(不全切透)。用5 μl显微注射器抽取1 μl视网膜前体细胞悬液，将30G针头从切口处插入视网膜下腔，缓缓注入1 μl视网膜前体细胞悬液，针头在原地停留30 s后缓缓拔出，用棉签按压片刻以防止细胞悬液外漏。术后给予抗生素眼液滴眼。

1.8 上丘细胞移植 在立体定位仪上俯卧位固定麻醉后的模型大鼠。剪掉大鼠头顶部毛发，碘伏消毒后矢状位剪开头皮(切口长约1 cm)，去掉头皮下疏松结缔组织后用2% H2O2棉签涂擦颅骨外膜数秒，然后用吸耳球对着颅骨外膜反复吹吸至前囟暴露清楚(约在两侧外眦连线中点处)，用签字笔在该处做一标记。以前囟为原点，在立体定位仪上移动微量注射器向右1.5 mm，向后6 mm，在针尖相对处的颅骨表面再做一标记，用微型电钻在该处钻开颅骨，深度至硬脑膜表面。用微量注射器吸取1 μl视网膜前体细胞悬液，向下移动微量注射器使针尖贴在硬脑膜表面。再次确认微量注射器针尖贴在硬脑膜表面后，开始缓慢下降微量注射器，距硬脑膜下6 mm 为注射点(右旁开1.5 mm，前囟后6 mm，硬脑膜下6 mm)。缓慢注射1 μl细胞悬液，留针10 min 后缓慢退针。生理盐水冲洗切口，红霉素软膏封闭颅骨钻孔，常规缝皮、消毒。

1.9 取材与观察方法 灌注后取左眼做冰冻切片。连续切片从颞侧开始，冰冻切片厚度为12 μm。不同眼球选择相同切面通过免疫荧光染色进行比较，染色后荧光显微镜下进行观察与拍照。每个标本选3张切片，每个切片选2个视野，测量标本距离视盘相对一致部位的视网膜厚度。

2 结 果

2.1 视网膜前体细胞视网膜下腔移植后在大鼠体内存活、迁徙与分化情况 见图1A-D。RIR成年SD大鼠视网膜下腔视网膜前体细胞移植术后8周，可在大鼠视网膜的外核层观察到表达绿色荧光的细胞；细胞迁移整合到外核层并可表达视杆细胞标识物视紫红质。内核层与神经节细胞层未发现表达绿色荧光的细胞。

2.2 视网膜前体细胞上丘移植后在大鼠体内存活、迁徙与分化情况 见图1E-H。RIR成年SD大鼠上丘视网膜前体细胞移植术后8周，可在移植部位观察到表达绿色荧光细胞，未发现移植细胞表达成熟视网膜细胞的特异性标志物视紫红质，视网膜各层均未发现表达绿色荧光细胞。

A、E：视紫红质；B、F：DAPI标记的细胞核；C、G：绿色荧光蛋白标记的视网膜前体细胞(箭头)；D、H：对照组

2.3 视网膜前体细胞移植后大鼠视网膜厚度变化 见图2。RIR成年SD大鼠视网膜下腔与上丘视网膜前体细胞移植术后8周，RIR组视网膜厚度与对照组、sham组比较均显著降低(均P<0.001)，与RIR+SC-PBS组、RIR+R-PBS组比较均无统计学差异(均P>0.05)；sham组视网膜厚度与对照组比较无统计学差异(P>0.05)；RIR+SC-C组视网膜厚度与RIR组、RIR+SC-PBS组比较均显著增加(均P<0.001)；RIR+R-C组视网膜厚度与RIR组、RIR+R-PBS组、RIR+SC-C组比较均显著增加(均P<0.001)。

注：***P<0.001

3 讨 论

上丘是大鼠视网膜初级投射区域，大鼠视网膜损伤与上丘联系密切，而视网膜下腔对于移植相对豁免，因此我们的实验选择视网膜下腔、上丘两个部位作为移植部位，观察视觉中枢移植与视网膜下腔移植对于缺血再灌注损伤视网膜的影响。Maclaren等[8]研究发现，移植的前体细胞能够整合到宿主视网膜并产生突触联系。本研究发现传代培养的第一代视网膜前体细胞移植到视网膜下腔后，这些供体细胞整合进宿主视网膜外层，表达视杆细胞标志物视紫红质，没有发现视网膜前体细胞迁移到神经节细胞层或表达神经节细胞的标志物，这与既往研究结果是一致的，移植的细胞很难分化为神经节细胞样神经元[9]。

本研究中，培养的第一代视网膜前体细胞移植到上丘后，视网膜前体细胞能够在上丘中存活至少8周，但是未发现移植细胞迁移到视网膜，这可能与观察时间长短以及视网膜切片的观察范围有关。近年研究[10]发现，通过激活代谢途径能够促进视网膜前体细胞的神经分化，促进视网膜前体细胞对损伤的修复。Chang等[9]研究发现，神经节细胞的分化可以被神经因子调控，促进干细胞分化为视网膜神经节细胞。Freude等[11]研究发现将人类诱导的多能干细胞通过磁激活细胞分离方法可以分离出Müller祖细胞与视网膜神经节细胞的祖细胞，这些特定类型细胞的移植可能更好地修复损伤的视网膜节细胞。后续研究也可以借助一些其他方法或途径来帮助视网膜前体细胞在移植体内迁徙与分化，达到更好的修复作用。

本研究发现，视网膜前体细胞移植到视网膜下腔8周后，RIR+R-C组视网膜厚度与RIR+R-PBS、RIR+SC-C组比较均显著增加，说明视网膜前体细胞视网膜下腔移植能够保护视网膜细胞，减少视网膜细胞的损伤。这样的保护作用可能与干细胞能够产生生长因子有关。研究[12]发现干细胞在体内外均可以产生生长因子如睫状神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)，对视网膜损伤具有保护作用。生长因子可以通过多种途径参与干细胞的神经分化，影响细胞的移植率[13]。视网膜前体细胞移植8周后，RIR+R-C组视网膜厚度与RIR+SC-C组比较显著增加，可能与移植细胞分泌的营养因子有关，视网膜下腔移植细胞更靠近损伤的视网膜，移植细胞分泌的营养因子能够更早、更多地到达损伤的视网膜，保护视网膜细胞，诱导干细胞分化，维持视网膜结构。

视网膜前体细胞移植到上丘8周后，RIR+SC-C组视网膜厚度与RIR+SC-PBS组比较显著增加，说明视网膜前体细胞上丘移植能够保护视网膜细胞，减少视网膜细胞的损伤。研究[14]发现，视网膜损伤能够诱导视网膜和脑相应区域早期和迟发的损伤。也有研究[15]发现，大鼠视网膜缺血再灌注损伤后3 d，可以发现对侧外侧膝状体背侧核和上丘神经元横截面积减少，胶质细胞激活。视网膜损伤后对侧外侧膝状体背侧核和上丘中BDNF与神经生长因子表达增加。

本研究中虽然移植后在损伤的视网膜未观察到移植细胞，但移植细胞在上丘一直存活，推测存活的移植细胞可能持续分泌一些细胞因子，而细胞因子通过特殊方式作用于损伤的视网膜，对视网膜起到保护作用。