HBsAg阴性伴HBcAb阳性患者血清HBV-DNA含量检测对隐匿性乙型肝炎病毒感染的检出价值

刘晓红，单 颖，孙朝庆，纪玉红，郭 静

(1.锦州医科大学基础医学院，辽宁 锦州 121001；2.朝阳市第二医院检验科，辽宁 朝阳 122000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)包含正嗜肝DNA病毒属和禽嗜肝DNA病毒属，其中正嗜肝DNA病毒属可引起人体HBV感染。乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)是目前临床判断HBV感染的主要乙型肝炎病毒血清标志物。血清HBsAg阳性可确诊HBV感染，若持续6个月以上阳性可确诊慢性HBV感染。乙型肝炎核心抗体(Hepatitis B core antibody，HBcAb)是人体HBV感染后最早出现的一种病毒抗体，单项HBcAb阳性提示既往HBV感染，HBsAg转阴和HBcAb出现提示HBV清除和乙型肝炎痊愈，且病毒清除后HBcAb仍会长期存在。随着荧光定量PCR的逐渐开展，发现HBsAg检测阴性但肝脏或血清HBV DNA含量阳性的现象并不少见，在排除HBV窗口期感染后可明确隐匿性乙型肝炎病毒感染(Occult hepatitis B virus infection，OBI)。既往研究[1-2]指出，依据血清是否存在HBcAb和乙型肝炎表面抗体(Hepatitis B surface antibody，HBsAb)，OBI患者的血清学可分为血清学阳性(HBcAb阳性，HBsAb阳/阴性)和血清学阴性(HBcAb、HBsAb均为阴性)，其中前者约占78%，后者约占22%，由此可见HBcAb阳性与OBI可能存在紧密关联。鉴于此，本研究对HBsAg阴性伴HBcAb阳性血清采用PCR仪进一步行HBV DNA含量检测，并对OBI检出结果进行探讨分析，为临床诊断OBI和降低OBI所致乙型肝炎病毒传播风险提供参考，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集朝阳市第二医院检验科2019年9月至2020年8月期间1138例经化学发光免疫分析法(CLIA)检测乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)且筛查结果提示HBsAg阴性伴HBcAb阳性的患者。其中，男性729例(64.06%)，女性409例(35.94%)；年龄18～73岁，其中18～29岁132例(11.60%)，30～59岁704例(61.86%)，60岁及以上302例(26.54%)，平均年龄(47.62±10.25)岁。所有患者既往均无肝肿瘤放化疗或手术史，排除HBV窗口期感染，均积极配合相关检测。本研究获得医院伦理委员会审核批准。

1.2 研究方法

1.2.1 血清样本采集：采集静脉血4 ml，3000 r/min离心10 min，收集血清置于冰箱-60 ℃保存，48 h内完成检测。

1.2.2 HBV-M检测：采用雅培ARCHITECT i2000SR化学发光免疫分析仪及配套试剂盒对HBsAg、乙肝病毒e抗原(Hepatitis B virus e antigen，HBeAg)、HBsAb、乙肝病毒e抗体(Hepatitis B virus e antibody，HBeAb)、HBcAb进行检测。HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb试剂盒批号分别为07395FN00、10267BE00、06440FN00、09197BE00、09542BE00，均购自雅培公司。根据CLIA定量分析结果判定HBV-M检测项目阳/阴性。

1.2.3 HBV-DNA含量检测：采用美国ABI 7500荧光定量PCR仪对HBV-DNA含量进行检测，试剂盒(批号：MF20160102)购于上海浩源科技有限公司。HBV-DNA含量值最低检出限为10 IU/ml。

1.2.4 肝功能检查：明确HBV-M检测结果后均建议进一步做肝功能检查，其中596例在我院接受肝功能检查。采用罗氏Cobas 8000生化分析仪及配套试剂检测血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和总胆红素(TBIL)水平。三者正常值范围依次为5～40 U/L、7～40 U/L和3～22 μmol/L，且AST/ALT值越高表示肝功能损伤越严重。由资深肝病医师综合判定肝损伤情况，必要时进行肝穿刺活检。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件对所得数据进行分析。根据研究需要对受检样本进行分组，组间比较采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 1138例患者不同HBV-M模式间HBV-DNA阳性情况比较 见表1。经PCR检测，1138例患者中35例为OBI，检出率3.08%。根据CLIA检测结果将1138例患者HBV-M检出模式分成模式A组(HBcAb阳性)、模式B组(HBcAb、HBeAb阳性)、模式C组(HBcAb、HBsAb阳性)和模式D组(HBcAb、HBeAb、HBsAb阳性)。HBV-DNA阳性检出率由高到低依次为模式C组、模式A组、模式B组和模式D组，其中模式A、B、C组HBV-DNA阳性率比较均无统计学差异(均P>0.05)；模式C组HBV-DNA阳性率明显高于模式D组(P<0.05)；模式A、B组与D组比较均无统计学差异(均P>0.05)。

表1 1138例患者不同HBV-M模式间HBV-DNA阳性情况比较

2.2 1138例患者不同HBcAb反应性间HBV-DNA阳性情况及分布比较 见表2。根据血清样本HBcAb吸光度/临界值(S/Co值)将1138例患者分为反应性A组(1.0≤S/Co值<5.0)、反应性B组(5.0≤S/Co值<10.0)和反应性C组(S/Co值≥10.0)，并将S/Co值≥10.0定义为高反应性。结果发现，反应性A、B、C组的HBV-DNA阳性率依次升高，且反应性C组HBV-DNA阳性率明显高于反应性A、B组，反应性B组HBV-DNA阳性率又明显高于反应性A组(均P<0.05)。HBV-DNA载量分布：<20 IU/ml者25例，占71.43%(25/35)；20～100 IU/ml者7例，占20.00%(7/35)；≥100 IU/ml者3例，占8.57%(3/35)。结果发现，反应性A、B、C组HBV-DNA分布比较均无统计学差异(均P>0.05)。

表2 1138例患者不同HBcAb反应性间HBV-DNA阳性情况及分布比较[例(%)]

2.3 596例患者不同肝功能间HBV-DNA阳性情况及HBcAb反应性比较 见表3。根据有无肝损伤将接受肝功能检查的596例患者分为正常组(459例)和肝损伤组(137例)。结果发现，肝损伤组HBV-DNA阳性率、HBcAb高反应性均明显高于正常组(均P<0.05)。

表3 596例患者不同肝功能间HBV-DNA阳性情况、HBcAb反应性比较[例(%)]

3 讨 论

近年来HBV相关研究和感染传播的防控工作取得长足进步，但HBV感染在世界范围内仍属于严重的公共卫生难题。HBV感染相关流行病学报道[3-4]指出，我国人群HBV感染呈高发流行特征，地区分布差异显著，HBV携带者高达10%，每年新增约50万人，且每年因HBV感染所致肝硬化、肝癌而死亡的人数高达26万。由此可见，HBV感染可造成沉重的社会负担，已成为居民死亡的常见病因，对HBV感染防控和相关诊治工作提出了更高的要求[5]。

自1978年医学界首次提出OBI以来，随着分子生物学技术和PCR检测技术的应用，相关研究已取得较大进步，认知水平明显提高。目前将OBI定义为：排除HBV感染急性窗口期以后，经严格检测明确HBsAg阴性，血清和(或)肝组织中HBV-DNA阳性，且HBV-DNA载量<200 IU/ml。既往报道[6]指出，HBsAg阴性献血者、隐匿性慢性肝炎、慢性丙型肝炎和原发性肝癌等均有OBI检出。但OBI发病机制复杂，至今尚未完全明确，给临床诊治及预防带来诸多困难，多猜测与HBV基因突变、HBV表观遗传变异、合并丙型肝炎病毒(HCV)以及宿主免疫应答反应等有关[7]。李奇等[8]对10359份血清样本进行检测，OBI检出率为0.191%，检出9种HBV-S基因主要亲水区(MHR)突变类型，且部分突变类型具有促进肿瘤生长的生物学特征，提示OBI可能增加肝细胞癌的进展风险。报道[9]发现，单纯HCV感染患者和HCV/OBI共感染患者的分子流行病学特征并无明显差异，也可能是导致部分OBI漏检的原因。HBcAb是临床评估HBV感染的标志性抗体，HBcAb阳性表示既往HBV感染，单项HBcAb阳性多见于急性HBV感染窗口期、HBcAb阳性孕妇所生新生婴儿和接受输血者等群体。由于OBI的流行病学特征极其复杂，不同地区、族群、性别、年龄的人群OBI发病情况统计存在诸多困难，加上目前检测技术存在差异，因此关于OBI的潜在影响尚存在一定争议，如OBI潜在传染性评估、是否增加肝细胞癌的罹患风险等还未形成统一观点。笔者在临床工作中发现，HBsAg阴性伴HBcAb阳性者并不少见，作为OBI患者的常见血清学特征，血清HBcAb水平可明显升高。

本研究收集的1138例HBsAg阴性伴HBcAb阳性患者的血清样本均经CLIA筛查明确。与常规酶联免疫吸附法(ELISA)比较，CLIA所需配套仪器和试剂成本提高，但检测时间明显缩短，而且灵敏度和特异度更高，因此应用广泛。此外，虽然时间分辨荧光分析技术(TRFIA)也具备较好的检测效果，但检测时间长，且标本消耗量大，检测技术要求较高，并未广泛应用。进一步行PCR检测显示，共检出35例OBI患者(HBV-DNA阳性)，检出率为3.08%，此结果明显高于报道[10]中的0.90%，原因可能在于血清样本存在差异。35例OBI患者HBV-DNA载量均≤200 IU/ml，其中<20 IU/ml、20～100 IU/ml、≥100 IU/ml分别占71.43%、20.00%和8.57%，符合OBI的HBV低水平复制特征。不同HBV-M模式中，模式C组(HBcAb、HBsAb阳性)OBI检出率最高(4.11%)，其次为模式A组(HBcAb阳性)，模式D组(HBcAb、HBeAb、HBsAb阳性)检出率最低(1.61%)，分析原因与HBeAb阳性时体内HBV复制相对静止有关[11]。

本研究根据HBcAb反应性(S/Co值)进行分组，发现随着S/Co值升高，HBV-DNA阳性检出率也明显升高，HBsAg阴性伴高反应性HBcAb(S/Co值≥10.0)患者的OBI发病率高达14.29%，与既往报道[12]相符，提示CLIA筛查明确HBsAg阴性伴HBcAb阳性者若血清HBcAb水平异常偏高，OBI风险可能增加。有研究[13-14]发现，单独HBcAb阳性作为OBI的常见血清学形式，血清HBcAb水平与肝组织中共价闭合环状DNA(cccDNA)水平紧密相关，也在一定程度上支持本研究观点，但OBI患者cccDNA水平的影响因素复杂，血清HBcAb水平的影响作用途径尚未完全明确[15]。本研究显示反应性A组、B组和C组HBV-DNA分布比较无统计学差异，提示HBcAb反应性对OBI患者HBV-DNA分布无明显影响，但需后续研究扩大样本深入探讨。

本研究中596例患者接受常规肝功能检查，肝损伤者137例(22.99%)，结果显示肝损伤组HBV-DNA阳性率、HBcAb高反应性均明显高于正常组，结合上述讨论，提示HBsAg阴性伴HBcAb阳性患者可存在肝损伤，肝损伤亦提示较高OBI可能。因此，对存在OBI风险人群，建议定期进行肝功能检查。OBI患者必要时行肝穿刺活检，对评估肝损伤意义更大，若提示纤维化或炎症，则需积极接受抗病毒治疗[16]。但肝损伤原因除HBV感染因素外，还与患者饮酒、自身免疫性疾病、遗传代谢性、肥胖等因素有关，对结果可能造成一定偏倚，这也是本研究存在的不足之处。

综上所述，常规检测HBsAg阴性伴HBcAb阳性提示存在OBI可能，且OBI发生风险随HBcAb反应性S/Co值升高而升高，应进一步行HBV-DNA含量检测判断OBI，降低OBI漏诊和临床HBV传播风险。