急性肝衰竭大鼠模型构建实验研究

张荣臻，吕 超，石清兰，陈月桥，黄雪霞，毛德文

(广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023)

急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)是由多种因素诱发的肝细胞大块坏死或急剧弥漫性肝细胞变性、肝功能严重损害导致的临床综合征，以急性发病、黄疸急剧加深、肝脏迅速缩小、不同部位出血、短期内出现腹水以及神经精神状态改变为主要特征。由于患者突然大量出血、败血症、低血糖和肾衰竭，ALF病死率高达70%～90%，为给肝细胞再生提供充足时间，将各种并发症减少到最低限度是治疗的关键[1]。

建立高效、稳定的动物肝衰竭模型是进一步开展临床药物研究的重要前提。本研究主要是采用SD大鼠作为实验动物来构建急性肝衰竭模型。课题组经查阅文献后发现，目前肝再生研究的肝衰竭动物模型主要是90%肝切除大鼠模型，该模型首先由Johannes Gaub创建，随后经Emond等进行了完善。该模型能造成极度的肝功能损害，完美复制肝衰竭，多用来检验相应治疗措施的疗效。但也有报道指出该模型死亡率较高，可以通过降低肝切除比例来确定最佳的肝衰竭模型。为保证快速建立符合要求的ALF大鼠模型，课题组经过不断摸索，最终确定切除大鼠60%比例肝脏组织，术后腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)和脂多糖(LPS)来构建ALF大鼠模型，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：2月龄SPF级SD雄性大鼠(动物生产许可证号：SCXK湘2014-0011)30只，体重190～240 g，购自湖南长沙市天勤生物技术有限公司。饲养和实验均在广西中医药大学第一附属医院实验中心完成。动物饲养环境遵循实验中心条件，温度控制在24 ℃左右，光照时间按照12 h间隔，保持充足饲料和饮水，定期清理排泄物。整个实验周期大鼠生长正常，无疾病及感染发生。

1.1.2 试剂和仪器设备：主要试剂包括戊巴比妥钠注射液、生理盐水、葡萄糖氯化钠液、脂多糖(批号：L8880；Sigma)和D-氨基半乳糖(批号：G7219；Ruibio)。主要仪器包括电子计量天平、超净工作台、蒸汽灭菌锅和无菌手术工具包。

1.1.3 D-氨基半乳糖+脂多糖混合溶液配制：称取4.0 g D-GalN和2.0 mg LPS溶于80 ml生理盐水，用pH6.8氢氧化钠溶液调节pH值，用生理盐水调节容积至100 ml。采用0.22 μm过滤膜过滤除菌并保存。配制成每毫升含40 mg D-GalN和20 μg LPS的混合液。

1.2 实验方法

1.2.1 急性肝衰竭模型构建：30只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、手术组及模型组，每组10只。对照组常规饲养，不予手术处理。手术组及模型组均行60%肝切除术，术前12 h禁食，6 h禁水。1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，将大鼠固定于手术台上，腹部备皮。操作人员戴无菌手套，铺无菌孔巾，碘伏消毒液擦拭手术部位消毒。用手术刀沿大鼠腹中线从剑突下1 cm处切开，伤口长3～4 cm，仔细分离肝脏周围韧带，将大鼠肝叶(中叶、左叶、右叶、尾页)暴露在视野中。轻拨肝脏，将各页肝蒂露出，使用1个0号丝线结扎含肝右叶静脉的肝蒂，切断肝右叶(肝右叶占全部肝脏的60%)。手术操作过程中未发生大出血、死亡等情况。完成手术后缝合切口，再次消毒后用无菌纱布包扎，予以消毒棉保暖，重新放置于动物房饲养室中。待大鼠苏醒后，将配置好的D-GalN及LPS混合液按0.5 ml/100 g进行腹腔注射，后续予以糖盐水和饲料喂食。

1.2.2 标本收集与处理：对照组、手术组、模型组在造模后24、48 h分别静脉采血，分装好后于-80 ℃保存。两个时间点分别处死3～4只大鼠，分离大鼠肝脏，在距离肝脏边缘0.5 cm处取肝组织小块，PBS冲洗后置入10%甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋、切片，进行HE染色。血清样本采用贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪进行分析，检测肝功能指标天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及总胆红素(TBIL)水平。

2 结 果

2.1 三组大鼠一般情况 造模期间，对照组大鼠表现活泼，毛发有光泽，进食正常，大小便正常；手术组大鼠活动度尚可，精神一般，反应减弱，毛发较稀疏，食欲尚可，二便少；模型组大鼠行动迟缓，反应迟钝，肢体蜷缩，毛发枯黄，食欲差，二便少。

2.2 三组大鼠生存情况 对三组造模后大鼠进行生存情况统计，结果发现模型组大鼠在造模后48 h内死亡3只，48 h生存率为70%，对照组及手术组无死亡。

2.3 三组大鼠肝功能指标比较 见表1。造模后24、48 h，手术组与模型组大鼠ALT、AST、TBIL水平均高于对照组，模型组大鼠ALT、AST、TBIL水平均高于手术组(均P<0.05)。

表1 三组大鼠肝功能指标比较

2.4 三组大鼠造模后肝组织HE染色结果 见图1。手术组大鼠造模后24 h肝组织HE染色结果显示肝细胞弥漫性水肿，肝组织结构尚正常，有点状坏死；造模后48 h，肝细胞呈片状坏死，结构紊乱，可见炎性细胞片状浸润。模型组造模后24 h HE染色结果显示肝细胞呈灶状坏死，结构紊乱，可见肝细胞水肿；造模后48 h，肝细胞呈大块状坏死，结构紊乱，相比造模后24 h坏死区域面积扩大，达到肝衰竭模型标准。

3 讨 论

ALF是由肝炎病毒、药物、肝毒性物质、手术损伤等多种因素诱发的肝细胞大块坏死或急剧弥漫性肝细胞变性、肝功能严重损害造成的临床综合征。目前仍缺乏特效治疗药物，患者自然死亡率高达70%～90%[1-3]。因此，建立高效的ALF动物模型对临床研究、诊疗均有着重要意义。由于大鼠的生理及代谢特点与人类相似，而且基因组同源性也较高，因此成为重要的实验对象。另外，对于大鼠基因组的研究目前较为透彻，因此用大鼠建立ALF动物模型十分必要。

诱导大鼠ALF模型的方法很多，但机制不同，病理生理改变及临床诊疗方式也不尽相同。腹腔注射刀豆蛋白A[4]、D-GalN+LPS[5]、硫代乙酰胺[6]，酒精[7]、四氯化碳[8-9]灌胃，肝部分切除术[10]均可引起ALF，这些方式分别会引起免疫性肝损害、肝细胞凋亡、肝细胞膜通透性改变、肝细胞纤维化、肝细胞脂肪性病变、肝脏缺血再灌注等肝细胞损害，从而形成肝衰竭模型。治疗肝衰竭的根本方法是肝移植术，而明晰其免疫和再生机制是提高肝移植存活率的关键。理想肝切除术模型的建立对研究肝再生、肝移植、肝癌切除术、肝衰竭预后以及降低致死率都有着十分重要的意义。Johannes Gaub创建的90%肝切除大鼠模型可完美复制ALF，但操作难度大，大鼠死亡率高，不利于实验观察。课题组通过降低肝切除比例来确定合适肝衰竭模型，最终建立了切除大鼠60%肝脏组织，术后腹腔注射D-GalN+LPS混合溶液来构建ALF大鼠模型的方法。

肝脏缺血再灌注损伤(IRI)是肝移植术后肝衰竭的主要原因。IRI可分为由肝细胞损伤引起的热IRI及由肝窦内皮细胞(LSEC)损伤和微循环障碍引起的冷IRI。两种类型IRI均通过肝脏Kupffer细胞和中性粒细胞激活、细胞因子和趋化因子产生、活性氧释放诱导肝细胞损伤，引发肝衰竭[11-13]。D-GalN、LPS联用可加剧肝细胞损伤，激活Kupffer细胞产生各种炎性因子[14]，并激活Caspase酶、启动子Caspase-8和Caspase-9等多种凋亡信号，从而激活效应细胞Caspase-3，裂解细胞底物聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)，触发凋亡程序，导致肝细胞坏死[15]，加剧肝衰竭形成。

90%肝切除模型大鼠死亡率过高，药物观察时间窗较短，不利于疗效观察，因此从观察肝再生角度来看，ALF最佳动物模型造模方式是手术联合药物。本研究中，60%肝切除+20 mg/100 g D-GalN+10 μg/100 g LPS腹腔注射构建大鼠ALF模型后24、48 h检测血清肝功能指标并对肝组织进行HE染色，结果显示手术组与模型组大鼠ALT、AST、TBIL水平均高于对照组，模型组大鼠ALT、AST、TBIL水平均高于手术组；手术组24、48 h HE染色结果与ALF病理特征吻合度不高，但模型组HE染色结果显示造模后24 h大部分区域细胞已经坏死，造模后48 h坏死区域进一步扩大，达到了ALF要求。

在构建急性肝衰竭大鼠模型中，笔者体会如下：①应掌握熟练的操作技巧，以避免因手术操作不当导致大鼠失血过多而死亡；②严格无菌操作，以避免因细菌感染加重大鼠病情，导致大鼠死亡；③严格按照大鼠体重及药物浓度计算药物剂量，以避免因药物剂量不足或过多导致造模失败；④应避免药物注入大鼠血管及肠道内而导致大鼠死亡；⑤造模过程应注重预实验，依据大鼠型号及药物制定适宜的造模方法。