脂多糖通过NOD样受体蛋白3炎症小体通路诱导大鼠急性肝损伤实验研究

黄 珊，宁佐伟，王国正，李 洋，罗晓英，金思一

(1.广东省妇幼保健院内科重症监护室，广东 广州 511400；2.南方医科大学南方医院消化科，广东 广州 510515)

近年来脓毒症造成的肝损伤逐渐引起医生的关注[1]。肝脏在脓毒症发生与发展过程中起着重要作用，其介导的免疫炎症反应既能清除体内细菌与毒素，又可能导致炎症放大、免疫抑制与器官损伤，而肝脏正是脓毒症最常见的损伤器官[2]。脓毒症造成肝损伤，而肝损伤又会加剧脓毒症的严重程度，因此探究脓毒症相关肝损伤的病理生理机制将有助于从相应信号通路着手研究治疗脓毒症的新策略。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌表达的内毒素。既往研究[3]已表明，LPS会诱导肝细胞凋亡，造成线粒体结构紊乱，导致肝细胞变性坏死，但其具体的分子机制仍有待深入探讨。炎症小体是一种多蛋白复合体，是机体免疫系统的组成部分，能够识别外来病原微生物与内源性损伤等信号，从而激活下游相关靶信号，调控炎症反应，抵抗病原体感染与应激损伤，但其在过度活化的状况下会导致组织器官产生炎症损伤[4]。NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)是近年来临床研究的热点炎症小体之一，目前对于NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体的研究较为深入，已经发现多种病原体及其成分均可活化NLRP3炎性复合体[5]。本研究采用不同浓度LPS刺激大鼠及肝原代细胞，探讨其对肝组织的影响，并以NLRP3炎症小体相关基因的表达情况为观察指标，分析LPS造成急性肝细胞损伤的信号传导机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SD大鼠购自广东医学实验动物中心，动物合格证号为SYXK(粤)2019-0192，平均体重为200～300 g，分笼饲养，饲养温度为14～16 ℃。本研究符合一般动物学伦理要求。

1.1.2 实验试剂：LPS(L2630)购自美国sigma公司；Hoechst 33342细胞凋亡染色试剂盒购自Sigma公司；CCK-8试剂盒购自南京固与生物；胎牛血清与DMEM培养基购自Gibco公司；抗NLRP3抗体(ab214185)、抗凋亡相关斑点样蛋白(ASC)抗体、抗白介素-1β(IL-1β)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔免疫球蛋白(IgG)购自Abcam公司；PH0722兔抗体免疫组化试剂盒购自福州飞净生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 诱导大鼠急性肝损伤：将6只SD大鼠随机分为对照组与LPS组，各3只。LPS组腹腔注射LPS(10 mg/kg)，对照组注射等量生理盐水。注射24 h后抽取外周静脉血测定肝丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。取血后对所有大鼠行腹腔麻醉，取肝左叶组织以10%中性甲醛固定，脱水后以石蜡包埋切片，HE染色后置于显微镜下观察。

1.2.2 免疫组化测定蛋白表达：将1.2.1中肝组织石蜡切片进行脱蜡处理，抗原修复后以3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，PBST冲洗3次，每次3 min。以10%山羊血清室温孵育30 min，标本放于湿盒中，添加1∶100稀释后的一抗4 ℃孵育过夜，PBST冲洗3 min×3次。添加生物素标记的二抗37 ℃孵育1 h，PBST冲洗3 min×3次。DAB显色剂显色，PBST冲洗3 min×3次。苏木素浸泡标本3 min，去离子水冲洗3 min，脱水，透明，封片剂封片，置于显微镜下观察。

1.2.3 肝原代细胞提取：取健康SD大鼠，将其麻醉后分离肝门静脉，置入留置针，以15 ml/min速度灌注37 ℃预热前灌液10 min。分离肝脏后灌液以5 ml/min速度灌注15 min。肝脏浸入分散液，剪去肝脏包膜，37 ℃水浴20～30 min。以70 μm筛去除杂质，留下肝细胞悬液，离心纯化后得到肝原代细胞。

1.2.4 细胞培养与分组实验：将1.2.3中的肝原代细胞置于37 ℃、5% CO2、湿度饱和的恒温培养箱中，以含有20%胎牛血清的DEME培养，取对数期细胞分为空白对照组、L-LPS组与H-LPS组进行实验。空白对照组、L-LPS组与H-LPS组细胞在饥饿后分别在含0、100、1000 ng/ml LPS的培养基中继续培养24 h，进行后续检测，以下每种实验均重复3次。

1.2.4.1 增殖与凋亡测定：将各组细胞取出，每孔加入10 μl CCK试剂，于37 ℃孵育2 h，采用酶标仪检测450 nm处吸光度(OD)，细胞增殖活力=各组OD值/对照组OD值。收集各组细胞，PBS洗涤3次后加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤后加入10 μg/ml Hoechst 33342避光孵育15 min，PBS洗涤后在荧光显微镜下观察，每孔随机选取5个视野，采用Image J软件计算每张图片在相同放大倍数下的总细胞数和Hoechst阳性细胞数，计算凋亡率。凋亡率=Hoechst阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4.2 mRNA相对表达量测定：以TRIzol法提取各组细胞总RNA，以分光光度计测定RNA纯度与浓度，纯度合格后取1 μg总RNA进行逆转录，再以逆转录产物cDNA作为模板进行实时荧光PCR扩增，以2-△△Ct法计算相对表达含量。

1.2.4.3 蛋白质表达测定：分别提取各组细胞内总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将其电转至PVDF膜，完成后取出PVDF膜并以5%脱脂牛奶封闭，添加一抗(1∶1000)于4 ℃过夜，再使用HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5000)室温孵育1 h，清洗PVDF膜后加入显色液，采用凝胶成像系统拍照，软件计算灰度值作为蛋白的表达量。

2 结 果

2.1 两组大鼠ALT与AST水平比较 见表1。LPS组大鼠腹腔注射LPS 24 h后，ALT、AST水平均较对照组明显升高(均P<0.05)。

表1 两组大鼠ALT与AST水平比较(U/L)

2.2 两组大鼠肝组织HE染色结果 见图1。对照组中肝细胞形态正常，组织结构正常。LPS组大鼠腹腔注射LPS 24 h后，肝脏HE染色可见大量炎症细胞浸润，肝细胞肿胀、局灶坏死，提示LPS刺激可导致大鼠急性肝细胞损伤。

图1 对照组(左)与LPS组(右)大鼠肝组织染色结果(HE染色，×100)

2.3 两组大鼠肝组织NLRP3与ASC蛋白表达情况 见图2。LPS组大鼠肝组织细胞质被染成黄褐色，表示NLRP3、ASC蛋白表达阳性，而对照组几乎未见染色阳性细胞，提示LPS可能通过NLRP3炎症小体通路导致急性肝细胞损伤。

A：对照组NLRP3；B：LPS组NLRP3；C：对照组ASC；D：LPS组ASC

2.4 三组肝原代细胞增殖与凋亡情况比较 见表2。与空白对照组相比，LPS刺激后肝原代细胞增殖率均有所降低，凋亡率均有所升高，且H-LPS组细胞增殖率低于L-LPS组，细胞凋亡率高于L-LPS组(均P<0.05)。

表2 三组肝原代细胞增殖与凋亡情况比较(%)

2.5 三组肝原代细胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相对表达量比较 见表3。与空白对照组相比，LPS组肝原代细胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相对表达量均增加，且H-LPS组均高于L-LPS组(均P<0.05)。

表3 三组肝原代细胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相对表达量比较

2.6 三组肝原代细胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白相对表达量比较 见表4。与空白对照组相比，LPS组肝原代细胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表达量均明显增加，且H-LPS组均高于L-LPS组(均P<0.05)。

表4 三组肝原代细胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白相对表达量比较

3 讨 论

炎症是机体对病原菌感染与组织损伤产生的一类快速应激反应，属于机体先天免疫过程中的一项保护措施，对于控制感染、适应性免疫、修复受损组织、维持机体稳态均有着十分重要的意义。但它也可能导致严重的不良后果，如免疫功能障碍、组织损伤、器官衰竭甚至死亡，脓毒症肝损伤便是炎症反应过度造成的[6]。NLRs炎症小体是炎症反应中的重要组成部分，其中NLRP3炎症小体信号通路是近年来临床研究的热点。既往研究[7-8]表明NLRP3在感染性疾病、自身免疫疾病、代谢紊乱、神经退行性疾病等均表现为过度激活状态，能被多种刺激激活，包括环境因素、外源性微生物及内源性危险信号等。

本研究通过采用不同浓度革兰氏阴性菌内毒素LPS分别刺激大鼠及肝细胞，探讨LPS所致肝细胞损伤与NLRP3炎症小体通路相关基因表达的关系，以期为脓毒症肝损伤的治疗提供新的靶点。结果显示，与对照组相比，大鼠注射LPS 24 h后血液中转氨酶含量明显升高，肝组织HE染色可见大量炎症细胞浸润，肝细胞肿胀、局灶坏死，提示LPS刺激可导致大鼠急性肝损伤；LPS组大鼠肝组织细胞质被染成黄褐色，表示NLRP3、ASC蛋白表达阳性，而对照组几乎未见染色阳性细胞，提示LPS可能通过NLRP3炎症小体通路导致急性肝损伤。

本研究进一步采用LPS刺激肝原代细胞后发现，与空白对照组相比，LPS处理的两组细胞增殖率均有所降低，凋亡率均有所升高，且NLRP3、ASC、IL-1β mRNA与蛋白表达量均明显增加，且H-LPS组细胞增殖率低于L-LPS组，细胞凋亡率高于L-LPS组，同时H-LPS组NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表达量高于L-LPS组。相关研究[9]表明，病原微生物来源物与内源性损伤信号分子刺激均可能诱导炎性复合体装配。当LPS刺激肝原代细胞后，细胞内发生了一系列改变(如溶酶体破裂，细胞器渗透入细胞质导致细胞膜完整性丧失，细胞氧化还原平衡被打破等)，诱导肝细胞凋亡，同时激活了NLRs信号[10-11]。NLRs信号活化后，NLRP3炎症小体与衔接分子ASC结合成复合物，首先募集半胱氨酸蛋白酶前体并使其发生水解成为具有生物活性的成熟的半胱氨酸蛋白酶[12]。半胱氨酸蛋白酶不具备直接调控凋亡作用，但在炎症反应与细胞凋亡中发挥关键作用，可通过对促炎因子前体pro-IL-1β进行剪切，使其成为成熟IL-1β并释放，进一步放大炎症级联反应，诱导炎性细胞死亡[13]。潮蓉等[14]采用小鼠构建酒精性肝损伤实验发现，P2X7、NLRP3、ASC、IL-1β表达明显升高，使用P2X7特异性阻断剂A438079后上述基因表达明显降低，因此酒精诱导的肝损伤可能与P2X7R-NLRP3信号通路有关。Wang等[15]从不同角度揭示了细菌感染诱发肝损伤的可能机制，指出肠肝轴可能通过胆汁酸代谢连接了肝脏与肠道，胆汁酸失调导致肠道失调，革兰阴性细菌等肠源性病原菌可通过门静脉进入肝脏，从而激活NLRP3炎性小体，诱导促炎细胞因子产生，引发肝脏炎症。本研究结果与上述研究具有一致性。

综上所述，LPS刺激大鼠后造成急性肝损伤，肝酶水平急剧上升，且肝组织出现明显炎症与坏死，大鼠肝组织免疫染色及肝细胞蛋白凝胶电泳检测均发现NLRP3炎症小体蛋白表达量上升，表明其诱发肝损伤可能是通过上调肝组织中NLRP3炎症小体通路来实现的。