艾灸百会穴对MCAO大鼠学习记忆能力及海马Bcl-2、Bax的影响

刘 芳 余李强 聂平英 陈心铭 林少鸿 郭佳颖 林 楠

脑卒中又称“中风”，为全球高发病[1]。卒中后认知功能障碍(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是卒中后最常见表现之一，研究表明PSCI的总发病率高达80.97%[2]。目前，PSCI的发病机制未完全阐明，但是研究发现神经元凋亡是影响卒中后神经功能恢复的一个重要因素[3]，而在分子水平上，Bcl-2家族蛋白在凋亡途径中发挥重要作用[4]。故本研究采用大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)缺血再灌注损伤大鼠模型，通过艾灸百会穴，观察对MCAO大鼠学习记忆能力、脑梗死体积及Bcl-2、Bax的影响，明确艾灸对PSCI的效果及潜在机制，为艾灸治疗PSCI的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

健康SPF级雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠30只购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005]。由福建中医药大学实验动物中心统一无菌环境饲养，适应性喂养10 d，体质量(270±20)g，按照随机数字表法随机分为假手术组、模型组和艾灸组各10只。所有动物实验均经过福建中医药大学实验动物管理委员会审批通过并严格按照我国相关实验动物的规定执行。

1.2 MCAO大鼠模型制备

模型组和艾灸组大鼠采用LONGA[5]和NAGASAWA[6]等制定的改良线栓法进行MCAO模型制备，具体步骤如下：备MCAO模型线栓(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，直径0.38～0.40 mm，分别在距离光滑面20 mm和22 mm处用记号笔标记，于实验前将线栓置于75%乙醇消毒后置于生理盐水中备用。首先根据大鼠称重结果，以10%水合氯醛按照3.0 mL·kg-1进行麻醉，然后用皮筋将大鼠固定于鼠板上，充分暴露颈部，局部剪毛备皮，消毒，再沿颈部正中切开皮肤，暴露并依次分离左侧颈总、颈内、颈外动脉主干及其分支，结扎颈外和颈总动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端，然后于左侧颈总动脉的结扎处上方剪一小口，将线栓沿着颈总动脉向颈内动脉方向轻缓推入，推入到颈内动脉夹闭处时松开动脉夹，继续轻推至颅内，直至感到有轻微阻力且插入深度约为20 mm时不再推入，实现大脑中动脉栓塞致脑缺血并记录时间。脑缺血后1.5 h，将部分线栓抽出并剪断创口外的部分，从而实现大脑中动脉再灌注，造模结束。大鼠清醒后2 h内，根据Zea Longa法[6]进行神经功能评分，分为0～4分，共5个等级，1～3分说明MCAO造模成功，0分或者4分说明造模不成功予以剔除。假手术组大鼠仅分离其左侧颈总、颈内、颈外动脉，不结扎也不插线。

1.3 干预方法

造模完成后第2天，艾灸组大鼠进行艾灸干预。根据中国针灸学会实验针灸研究分会制定的“动物针灸穴位图谱”中大鼠穴位定位方法[7]，将大鼠装入固定器中，采用自制的直径约8 mm艾条，在大鼠“百会穴”上方2～3 cm处施温和灸，每次30 min，每日1次，持续7 d。模型组和假手术组大鼠仅给予同等抓取及固定，不予任何干预治疗。

1.4 观察指标

1.4.1Morris水迷宫实验：水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验2个部分。(1)定位航行实验用于检测大鼠获取经验(学习)的能力，于干预后第2天至第4天进行。每次将实验大鼠置于平台10 s后，分别将其从4个象限的入水点面壁式放入水池，当找到平台后则栖身其上，如大鼠在平台上停留时间>3 s，则认为大鼠找到平台，即为逃避潜伏期，如果大鼠在90 s内未找到平台，则潜伏期按90 s计算。逃避潜伏期时间越短说明大鼠的学习能力越强。(2)空间探索实验用来检测大鼠保存经验(记忆)的能力，于干预第5天进行。撤去平台，将大鼠面向池壁从第一象限的入水点放入水中，记录90 s内大鼠穿越原平台相应位置的次数。次数越多表明大鼠的记忆能力越好。

1.4.2脑梗死体积测定：干预7 d后，进行小动物功能核磁共振仪(functional magnetic resonance imaging，fMRI)T2加权成像(T2-weighted imaging，T2WI)扫描，观察大鼠大脑梗死体积。操作前，先将大鼠放入充满0.3%异氟烷的密闭盒子4 min进行麻醉，再将其俯卧位固定在fMRI扫描床上进行定位扫描，每次扫描21层。扫描所得原始数据用Image J软件计算脑梗死区域面积，得出脑梗死面积和全脑面积数值。占位百分比=[每层脑梗死面积×(层间距+层厚)]/[同一层全脑面积×(层间距+层厚)]×100%。

1.4.3免疫印迹法(Western blotting)检测Bcl-2、Bax相关蛋白的表达：取大鼠海马组织剪碎，用匀浆器匀浆后置于冰上，加入含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液进行研磨至完全裂解后充分混匀，离心取上清液。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书配制标准蛋白溶液和适量BCA工作液，充分混匀。用酶标仪测定各样本蛋白浓度，根据标准曲线计算各样本上样量(上样量=50 μg/蛋白浓度)。按每4 μL蛋白样品加入1 μL蛋白上样缓冲液(4∶1)配比进行混合，使蛋白充分变性、配胶，经电泳、转膜、孵育、浸洗等，将膜取出，平铺于工作台上，加ECL显影液试剂，放入暗室中，静置反应1 min。运行Bio-Rad Image软件生物图像分析系统分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 实验大鼠存活率

本研究最终存活大鼠为假手术组10只，模型组9只，艾灸组8只。其中艾灸组大鼠1只造模当天神经行为学评分4分且于干预第1天死亡，1只大鼠于干预第7天进行核磁扫描不耐受麻药死亡；模型组大鼠1只于干预第4天被同伴咬死。

2.2 各组大鼠学习记忆功能比较

定位航行实验，干预第2天模型组和艾灸组逃避潜伏期均长于假手术组；第3天和第4天艾灸组和假手术组逃避潜伏期短于模型组，见表1～3。

表1 各组大鼠干预第2天的逃避潜伏期比较 [M(QL～QU)]

空间探索实验，艾灸组和假手术组大鼠穿越平台次数多于模型组，见表4。

表2 各组大鼠干预第3天的逃避潜伏期比较 [M(QL～QU)]

表3 各组大鼠干预第4天的逃避潜伏期比较 [M(QL～QU)]

2.3 各组大鼠脑梗死体积比较

各组大鼠行脑fMRI T2WI扫描，高信号白色区域为缺血梗死部位；假手术组未出现梗死病灶；且脑组织结构较清晰，左右对称，脑室居中，无萎缩，灰质和白质均无水肿、坏死及结构紊乱。模型组大鼠梗死灶呈弥漫性，面积较大，而艾灸组同模型组比较，脑组织水肿减轻，梗死区域呈纤维样变，脑梗死体积总和以及百分比均小于模型组，如图1。采用Image J软件计算梗死体积数值，艾灸组百分比小于模型组，差异有统计学意义，见表5。

(红色箭头指示梗死部位)

表5 各组大鼠脑梗死体积比较

2.4 各级MCAO大鼠Bcl-2、Bax比较

模型组大鼠脑组织皮质区Bcl-2的蛋白表达量减少，Bax蛋白浓度升高，而艾灸组Bcl-2的蛋白表达量明显上升，Bax蛋白浓度降低。见图2。假手术组Bcl-2/Bax比值最大，其次为艾灸组，最小为模型组；艾灸组与模型组比较差异有统计学意义。见表6。

图2 各组脑组织Bcl-2、Bax蛋白检测结果

表6 各组Bcl-2/Bax比值结果

3 讨论

中医认为，脑卒中后由于瘀血闭阻、气血运行不畅、痰蒙清窍等均可引起认知障碍。现代医学研究表明，认知功能障碍是由神经元凋亡和代谢减少而引起的[8-9]。脑卒中特别是脑缺血后，局部缺血再灌注损伤可引起一系列复杂的病理生理过程，进而引起神经元细胞的凋亡与坏死，最终导致卒中后认知功能障碍。艾灸百会穴是借助艾火的“温经通络”作用，通过刺激脑府及督脉穴位，总督和调节人体阳脉的经气，以调理脏腑阴阳，使元气得布，元神之府得充，进而达到疏通督脉，养脑调神的作用。《针灸甲乙经》谓“百会”为手足三阳经、督脉之会，有醒脑开窍、升阳举陷之功效，主治风证和神志病。课题组前期通过系统评价及数据分析表明百会穴是治疗PSCI选穴频率最高且有效的穴位[10-11]。本研究结果说明，艾灸百会穴可明显改善缺血性脑卒中后大鼠的学习记忆能力；本研究采用fMRI T2WI扫描观察大鼠左侧脑梗死体积发现假手术组未出现梗死病灶；艾灸组脑组织水肿减轻，梗死区域呈纤维样变，脑梗死体积总和以及百分比均小于模型组。可见，艾灸百会穴可以促进缺血脑组织的修复，缩小脑梗死体积，从而改善MCAO大鼠神经功能缺损情况，提高大鼠认知功能。

现代医学研究表明，认知功能障碍是由神经元凋亡和代谢减少而引起的。Bcl-2家族是调节细胞凋亡途径中的一个重要调节基因。Bcl-2家族包括两类，一类对细胞凋亡起抑制作用，如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等；而另一类则对细胞凋亡起促进作用，如Bax、Bak、Bad等。研究表明，Bcl-2 家族中抑制凋亡的基因，可以通过调节线粒体膜通透性稳定线粒体，从而阻止线粒体释放Cyt-c等凋亡相关蛋白，抑制细胞凋亡的发生；相反的，Bcl-2 家族中促进凋亡的基因，则可以破坏线粒体膜的稳定性，从而促进细胞凋亡的发生[12]。Bcl-2 不仅对线粒体有调控作用，对内质网也有调控作用。实验证明，Bcl-2 可以阻断内质网应激介导的Cyt-c释放和Caspase-3 激活[13]。大量研究证实，Bcl-2/Bax比值在Cyt-c释放和Caspase激活中起着关键作用[14]。本实验结果显示，模型组大鼠海马组织Bcl-2的蛋白表达量减少，Bax蛋白浓度升高，而艾灸组Bcl-2的蛋白表达量明显上升，Bax蛋白浓度降低，Bcl-2/Bax提高，提示艾灸可抑制MCAO大鼠海马神经细胞凋亡的发生，促进大鼠神经细胞修复，缩小脑梗死体积，从而改善其学习记忆功能。由此推测，艾灸干预PSCI的疗效与抑制神经细胞凋亡密切相关，其抗凋亡作用可能是通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平而实现的。该结论为艾灸疗法辅助治疗卒中后认知功能障碍的临床应用提供了理论支持，但本研究仅从凋亡相关蛋白阐明艾灸百会穴对PSCI的影响，其具体是如何减少神经元调亡，通过什么通路调节还有待进一步研究。

本研究发现艾灸疗法可通过抑制神经元凋亡，促进神经功能修复，从而改善脑卒中后认知功能障碍，后续可进一步研究艾灸促进中枢神经修复的通路及对神经修复微环境的影响，进一步阐明其机制。