大孔树脂对龙脷叶总黄酮的纯化工艺及其吸附特性研究

2021-03-15陈素雯邱思娃蔡延渠李苑新吴燕红

应用化工 2021年2期

陈素雯，邱思娃，蔡延渠，李苑新，吴燕红

(广东药科大学新药研发中心，广东广州 510006)

龙脷叶(SauropiFolium)是岭南地区常见的民族药，性平，味甘、淡，归肺、胃经[1-3]，能平肝肺之火、利痰，以使浊降清升、热去痰消，为民俗养生所喜。广东民间用龙脷叶治肺热咳嗽已有50余年的历史，验方记载：龙脷叶配伍红菱根、牛大力和五爪龙，合为清燥润肺、理气除痰之剂。近年来，黄酮类化合物在医疗和食品领域的应用逐渐广泛。

大孔树脂表面积较大，交换速度快,且热稳定性好，作为一种吸附性和筛选性原理相结合的分离材料，广泛应用于总黄酮的纯化研究。本文旨在建立富集龙脷叶总黄酮的纯化方法，阐明大孔树脂的吸附特性，为进一步开发利用龙脷叶总黄酮提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

龙脷叶(广东时珍制药有限公司，产地浙江，批号180801)；芦丁(中国食品药品检定研究院，ID：A7KT-934V，含量92.6%)；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、乙醇为分析纯；大孔树脂D101、AB-8、NKA9、HPD100、HPD600、DM301，参数见表1。

表1 不同型号的大孔树脂参数表Table 1 Parameters of macroporous resins of different models

UV1700分光光度计；ME204/02电子天平；HH-4数显恒温水浴锅；TC-15套式恒温器；RE-52AA旋转蒸发器。

1.2 龙脷叶总黄酮溶液的制备

称取250 g龙脷叶，剪碎分批置于圆底烧瓶中，加入50倍量水,加热,回流提取1.5 h。过滤，收集滤液。向滤渣中加入50倍量水,加热,回流提取1 h。过滤，合并滤液，浓缩至生药浓度1 g/mL。

1.3 实验方法

1.3.1 大孔树脂的预处理称取适量净品级干树脂，用95%乙醇浸泡，使树脂充分溶胀。湿法装柱，以95%乙醇洗脱，至洗脱液与水(1∶5)没有浑浊。再用蒸馏水冲洗柱子，至无醇味，且流出液与蒸馏水混合不产生浑浊为止。

1.3.2 大孔树脂的静态吸附和解吸称取大孔树脂0.5 g，预处理后置于50 mL锥形瓶中，加入20.00 mL样品溶液(生药浓度0.1 g/mL)，室温下，每隔5 min振摇10 s，持续120 min，静置24 h，使其充分吸附。滤过，即得树脂吸附后的溶液，测定吸附前后总黄酮浓度。

将吸附饱和的大孔树脂用适量水洗去未被吸附的溶液和停留在树脂表面的杂质，滤干，加入20.00 mL 70%乙醇溶液，室温下，每隔5 min振摇10 s，持续120 min，静置24 h，使其充分解吸，过滤，收集解吸液，测定总黄酮的浓度。

按下列公式分别计算树脂的饱和吸附量、吸附率、解吸量和解吸率。

Qe=(C0-CR)×V0/W

吸附率=[(C0-CR)/C0]×100%

Qd=(Cd×Vd)/W

D=(Qd/Qe)×100%

其中，Qe为树脂饱和吸附量，C0、CR分别为吸附前、后吸附液中总黄酮的质量浓度，V0、Vd分别为吸附液、解吸液的体积，W为干树脂质量，Qd为解吸量，Cd为解吸液浓度，D为解吸率。

1.4 总黄酮含量测定方法

参照文献[4-6]方法并进行修正，以芦丁为对照品，紫外分光光度法测定龙脷叶总黄酮含量。

精密称取0.001 2 g芦丁标准品于10 mL容量瓶中，加适量70%乙醇超声溶解，冷却后加70%乙醇定容至刻度，摇匀，即得0.12 mg/mL的芦丁标准溶液。分别精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL标准溶液于10 mL容量瓶中，加入500 μL 5%NaNO2溶液，摇匀，放置6 min。加入500 μL 10%Al(NO3)3溶液，摇匀，放置6 min。再加入4.0 mL 10%NaOH溶液，摇匀，放置30 min。用70%乙醇定容至刻度，摇匀。于最大吸收波长505 nm 处测定吸光度。以芦丁标准溶液质量分数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程A=0.011X-0.007 7(R2=0.999 8),即在6～30 μg/mL范围内线性关系良好。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂的筛选

6种大孔吸附树脂静态吸附及解吸附结果见表2。

由表2可知，HPD600静态吸附率最高，但其解吸附性能较差；HPD100、DM301静态吸附率与HPD600相近，且解吸率也较好；AB-8、D101虽然吸附率不高，但其解吸附性能好，解吸附量多。综上，选择HPD100、DM301、AB-8、D101进一步考察其动态吸附。

2.2 大孔树脂的动态吸附和解吸

分别称取AB-8、D101、DM301、HPD100树脂各5.0 g，处理后加入等量同浓度的样品溶液进行动态吸附、解吸，分别收集流出液、水洗液、洗脱液，测定吸光度，并计算各指标，结果见表3。

比上柱量S=(M上-M流)/W

(1)

比吸附量A=(M上-M流-M水)/W

(2)

比洗脱量E=M洗/W

(3)

保留率R=(M洗/M上)×100%

(4)

纯度P=M洗/W洗

(5)

式中M上——上样溶液中待分离化学成分的含量，mg；

M流——流出液中待分离化学成分的含量，mg；

M水——水洗液中待分离化学成分的含量，mg；

M洗——洗脱液中待分离化学成分的含量，mg；

W洗——洗脱液出膏量，mg。

表3 4种大孔树脂动态吸附解吸结果Table 3 Dynamic adsorption and desorption results of four macroporous resins

由表3可知，4种型号吸附树脂的比上柱量相近，差异不大，AB-8树脂纯化龙脷叶总黄酮的纯度高于其他树脂。故选择AB-8型号的树脂进行纯化工艺的优化。

2.3 AB-8纯化龙脷叶总黄酮工艺的优化

取0.5 g AB-8大孔树脂于50 mL的锥形瓶中，预处理后加入适量样品溶液，进行静态吸附，解吸附后，通过计算总黄酮吸附量或解吸量，考察上样溶液pH、上样浓度、洗脱溶剂对大孔树脂性能的影响。

取5.0 g AB-8大孔树脂，预处理后湿法装柱，将样品溶液上柱，待充分吸附后，用适量蒸馏水冲洗树脂柱，最后用乙醇溶液进行洗脱，通过计算总黄酮吸附量或解吸量考察上样流速、上样量、水洗用量、洗脱用量、洗脱流速对大孔树脂性能的影响，确定最适宜工艺参数[7-8]。

2.3.1 上样溶液pH对静态吸附的影响结果见图1。

图1 上样溶液pH对吸附效果的影响Fig.1 Effect of pH of sample solution on adsorption effect

实验过程中发现龙脷叶在强酸条件下会有沉淀析出，而在碱性条件下,总黄酮的吸附率较低，可能是因为部分黄酮类化合物含有酚羟基,呈弱酸性，在碱性条件下容易发生分解,而使结构发生改变，不利于与大孔树脂形成氢键，因此，不容易被树脂吸附。综上所述，将龙脷叶提取液pH调至5进行纯化为宜。

2.3.2 上样溶液浓度对静态吸附的影响由图2可知，浓度过低，树脂吸附不充分，吸附量少，不仅浪费树脂且纯化效率低；浓度过高，则容易出现树脂堵塞的现象，使大孔树脂吸附受阻;另外，浓度过高的溶液上柱时，泄露也会提前，使处理量减少。因此，选择料液比为0.167 mg/mL的提取液作为上样溶液为宜。

图2 上样浓度对吸附效果的影响Fig.2 Effect of sample concentration on adsorption effect

2.3.3 上样流速对动态吸附的影响图3表明,上样流速在1 mL/min时，总黄酮吸附量达到最大，随着流速的加快，吸附量明显减少。可能是因为流速过快，使吸附质来不及到达吸附位点就随溶液流出，泄露严重。因此,选择1 mL/min作为最佳上样流速。

图3 上样流速对吸附效果的影响Fig.3 Effect of sample loading velocity on adsorption effect

2.3.4 泄露曲线一般认为，当流出液中总黄酮浓度达到上样溶液中总黄酮浓度的1/10时，即达到泄露点。由图4可知，当收集的流出液体积达到40 mL时，树脂已出现明显的泄露现象，为保证能够充分利用树脂并不浪费样品溶液，提高纯化效率，选择上样液体积为1.5 BV。

图4 泄漏曲线Fig.4 Leakage curve

2.3.5 水洗脱曲线图5显示，当水洗用量达到100 mL时，大部分未被吸附、停留在树脂表面的总黄酮及其它杂质已经被洗脱下来，100 mL之后，再增加水洗用量作用不大。为节省时间,提高效率，选择水洗用量为4 BV。

图5 水洗脱曲线图Fig.5 Water elution curve

2.3.6 洗脱溶剂对静态解吸的影响由图6可知，低浓度和高浓度乙醇洗脱液中总黄酮质量浓度较低，难以破坏树脂与吸附质之间的作用力，乙醇体积分数为50%时，总黄酮解吸量最多，解吸效果最好。因此,选择50%乙醇作为洗脱溶剂。

图6 洗脱溶剂对解吸效果的影响Fig.6 Effect of elution solvent on desorption effect

2.3.7 溶剂洗脱曲线图7显示，当洗脱溶剂达到60 mL时，大部分总黄酮已被洗出；洗脱溶剂在60～100 mL时，仍含有部分总黄酮，100 mL之后，洗脱液中总黄酮含量极少。综合考虑成本和时间，选择洗脱溶剂用量为4 BV。

图7 溶剂洗脱曲线图Fig.7 Solvent elution curve

2.3.8 洗脱流速对动态解吸的影响图8显示，洗脱流速为2 mL/min时，总黄酮解吸量最多，解吸效率最高；流速过快时，洗脱剂与吸附位点的接触时间短，缩短了相互作用的时间，不足以将总黄酮全部解吸。因此,选择洗脱流速2 mL/min。

图8 洗脱流速对解吸效果的影响Fig.8 Effect of elution flow rate on desorption effect

2.3.9 工艺验证分别称取3份AB-8大孔树脂各5.0 g，预处理后装柱,按上述最优条件进行吸附和解吸附，测定流出液、水洗液、解吸液中总黄酮的质量浓度，计算各指标参数,结果见表4。

表4 龙脷叶总黄酮纯化参数Table 4 Purification parameters of total flavonoids from Sauropi Folium

由表4可知，总黄酮纯度从7.24%提高至22.17%，较纯化前提高了3.06倍，RSD值为0.95%，表明AB-8纯化龙脷叶总黄酮的工艺可靠稳定，能达到富集总黄酮的纯化效果。

2.4 树脂的吸附动力学

称取0.5 g AB-8大孔树脂，进行静态吸附，在不同吸附时间下取样，分别测定总黄酮质量浓度，计算吸附量。以吸附时间为横坐标，吸附量为纵坐标,绘制吸附动力学曲线，用准一级、准二级动力学模型和内扩散模型[7-10]对数据进行拟合，结果见图9、表5。

图9 吸附动力学曲线(A)和颗粒内扩散模型拟合曲线(B)Fig.9 Adsorption kinetics curve(a) and intra-particle diffusion model fitting curve(b)

表5 总黄酮吸附动力学参数Table 5 Adsorption kinetics parameters of total flavonoids

由图9(A)可知，在0～1 h内，AB-8对总黄酮的吸附量随着时间的延长大幅度增加；吸附1 h后，总黄酮吸附量增幅变缓，吸附率明显降低。图9(B)显示,颗粒内扩散模型拟合图为三段式非线性图，且直线不经过原点，说明AB-8对龙脷叶总黄酮的吸附是一个连续性的分段过程，吸附过程由液膜扩散和颗粒内扩散共同控制。表5显示,龙脷叶总黄酮吸附行为更符合准二级吸附动力学，表明吸附过程受化学吸附机理的控制。

2.5 树脂的吸附等温线

分别称取6份AB-8树脂各0.5 g,于50 mL的锥形瓶中，预处理后分别加入20.00 mL不同质量浓度的样品溶液，进行静态吸附，测定吸附后吸附液的总黄酮质量浓度，计算吸附量，以溶液质量浓度为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制等温吸附线，采用Langmuir、Freundlich吸附等温模型[9-12]进行拟合，结果见图10、表6。

图10 总黄酮吸附等温线Fig.10 Adsorption isotherm of total flavonoids

表6 35 ℃下总黄酮吸附等温线参数Table 6 Adsorption isotherm parameters of total flavonoids at 35 ℃

由图10可知，同一温度下,随着总黄酮质量浓度的增加，大孔树脂吸附量增加。总黄酮吸附符合Freundlich模型，表明可能为单分子层吸附，但难以实现理想体系下的单分子吸附现象。在Freundlich模型中，n<1，说明总黄酮吸附为非优惠吸附；ΔG=-8.66(kJ/mol)<0，说明总黄酮吸附过程是自发进行的。